★ 张嘉嘉 黄晓萱 马驰 杨漪 张勋*（福建中医药大学药学院 福州 350122）

赤芍为毛茛科芍药（Paeonia lactifloraPall）或川赤芍（P.veitchiiLynch）的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效［1］。赤芍主要含有两大类化学成分，即苷类和没食子酸及其衍生物，苷类主要活性成分有芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷等［2］。其中，芍药苷含量最高，《中国药典》中也是以芍药苷作为药材质量检测的目标成分。近几年的研究发现，芍药苷具有扩张血管、镇静镇痛、抗炎、抗溃疡的作用［3-4］；芍药内酯苷具有镇痛、抗炎、补血、抗抑郁等功效［5］；没食子酰葡萄糖具有抗癌、抗糖尿病等生物学活性［6-7］；没食子酸具有明显的抗氧化、抗炎等作用［8］。《中国药典》2015版一部主要以芍药苷的含量控制赤芍药材的质量，但是单一的成分控制无法从整体水平控制赤芍的质量。建立快捷、方便、可靠的同时测定多种赤芍活性成分检测方法对赤芍药材的质量控制具有重要意义。故本实验选择芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖以及没食子酸5种成分作为质量控制指标，分别测定了20个不同产地的赤芍中5种成分的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DF-15台式连续投料粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；AR224CN型电子分析天平（常州奥豪斯仪器有限公司）；KQ-500DE型医院数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；安捷伦1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；MILLI-Q Direct16 一体化超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 材料 赤芍对照药材（批号：120915-201109，中国食品药品质量检定研究院）；没食子酸（批号：B20851，上海源叶生物科技有限公司）；氧化芍药苷（批号：YY90574，上海源叶生物科技有限公司）；芍药内酯苷（批号：YY90477，上海源叶生物科技有限公司）；芍药苷（批号：B21148，上海源叶生物科技有限公司）；β-五没食子酰葡萄糖（批号：P816672，上海麦克林生化科技有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯（默克化工技术有限公司）；实验用水皆为实验室自制二次蒸馏水。20批赤芍饮片中Cs2015121401—Cs2015121419为赤芍饮片，Cs2015121420为赤芍对照药材，均经过福建中医药大学药学院黄泽豪老师鉴定）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性 Welch Ultimate®XBC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱，0～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A ；30～45 min，15%～30%A。流速1 mL/min；检测波长230 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL。5个对照品分离度良好，各峰的分离度均大于1.5。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取5种活性成分对照品没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖适量，加甲醇超声溶解制 成 346.8、319.6、198.0、366.8、353.6 μg/mL 的没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量，用甲醇稀释得每1 mL含173.4、159.8、99.01、183.4 和 88.4 μg上述 5 种成分的混合对照品溶液，即得，4 ℃下保存于冰箱中。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末过80目筛，精密称取0.25 g，置25 mL具塞三角烧瓶中，精密加入80%甲醇超声处理（功率240 W，温度60 ℃）30 min，放冷，补足失重。过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线 精密吸取“2.2”项下的混合对照品储备液于20 mL量瓶中，依次对半稀释得不同浓度的对照品混合液。按“2.1”项测定，以对照品的浓度（C，μg/mL）为横坐标（X），峰面积（A，mAU）为纵坐标（Y），分别绘制5个对照品的标准曲线，得到回归方程和相关系数，结果见表1。

表1 5种化合物的线性回归方程

2.4.2 精密度 取对照品混合液5 μL，按“2.1”项进行测定。一天内连续进样6次，记录峰面积。结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为0.57%、0.68%、0.11%、0.33%、1.2%，5种成分峰面积的RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性 精密称取同一份赤芍样品（批号：Cs20151216-18），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温环境下分别在0、2、4、8和12 h时进样5 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为2.57%、2.68%、2.37%、1.23%、2.41%，表明赤芍供试品溶液中各成分在48 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性 精密称取同一份赤芍样品（批号：Cs20151216-18），平行6份，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定各成分的峰面积。结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖峰面积的RSD分别为2.52%、2.31%、1.95%、1.07%、1.23%，5种成分峰面积的RSD均小于3%，表明本方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率 精密称取已知含量的赤芍样品粉末6份，分别加入样品含量50%的对照品溶液，按“2.3”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件进样，记录峰面积，计算平均加样回收率，结果没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖的平均加样回收率分别为100.21%、99.83%、100.22%、101.94%、100.79%，RSD分别为2.04%、2.21%、2.56%、1.01%、2.35%。

2.5 样品测定 分别取赤芍样品粉末约0.25 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，采用标准曲线法计算没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖的含量，结果如表2所示。

表2 20批赤芍样品5种成分含量 %

（续表）

3 讨论

3.1 检测波长的选择 将混合对照品溶液进行190 nm～400 nm紫外可见光全波长扫描，分别在250 nm和230 nm附近出现两个吸收峰，没食子酸、氧化芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖的最大吸收峰并不在230 nm，但方法学考察结果表明它们在230 nm有着很好的线性关系，可以用来定量检测，且发现在230 nm下各色谱峰的数目、分离度、丰度较好，故本研究选择230 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件考察 为寻求最佳色谱条件，本实验先后考察了不同提取溶剂、不同提取方式、不同提取时间、不同柱温、不同流速、不同流动相体系，结果表明，色谱条件选择Welch Ultimate®XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈和0.1%甲酸，柱温30 ℃，流速1 mL/min，80%甲醇处理30 min，各色谱峰的峰形、分离度较好。

4 结论

本文建立HPLC法，测定赤芍中没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、β-五没食子酰葡萄糖的含量。2015版《中华人民共和国药典》规定，赤芍饮片含芍药苷不得少于1.5 %，20批药材全部合格，但与对照药材相比，部分产地芍药内酯苷的含量过高，是对照药材的6～100倍，此外，各个产地的β-五没食子酰葡萄糖含量均高于对照药材，因此，仅仅用芍药苷作为赤芍的指标性成分，专属性不强，不足以反映白芍的总体质量。故本实验通过对赤芍没食子酸等5种成分含量的研究，初步对赤芍的质量进行了考察，方法简单，结果可靠，重复性好，为赤芍整体质量控制评价体系的建立提供了科学实验基础。