李莹莹，康超娣，张颖颖，赵文涛，李家鹏，李慧晨，王守伟

（北京食品科学研究院，中国肉类食品综合研究中心，北京 100068）

食品欺诈已成为食品质量和安全领域中较为显著的问题[1-2]。尤其是以肉类为主的高附加值的高度加工食品，属于掺假风险较高的一类食品。随着消费者的广泛关注以及掺假鉴别技术的涌现，掺假手段不断翻新且越来越隐蔽，通过特定的加工处理，如高温高压，或是添加辅料及添加剂（如盐、辣椒、防腐剂等）用于增强风味，遮蔽原有味道[3-4]，使得无法从外观识别物种形态[5-6]，或采用廉价肉类代替高价肉类以达到掺假的目的[7]。食品掺杂掺假现象不仅侵犯了消费者的利益，而且破坏了食品市场的秩序和食品安全质量监管[8-9]，甚至危害了消费者的身体健康，在某种程度上还会引发宗教问题[10-11]。因此，建立快速、高效、准确的掺假鉴别方法对于保障食品安全具有重要意义。

蛋白质组学以蛋白质为研究对象，具有高选择性、高通量和全面性等特点，可对一个基因组或组织、细胞全部的蛋白质进行鉴定和分析[12-13]，基于蛋白质组学的质谱方法作为一种新兴的方法是目前食品鉴伪的热点[14-15]。该技术将筛选的各物种靶标多肽作为分析目标[16]，不但可以实现对肉类成分的鉴别[17]，而且可以实现植物、动物的多物种同时鉴别，尤其适用于非常复杂和高度加工的食品基质[18-19]，是一种快速、灵敏、特异以及高通量判别方法[20]，能够满足当前监管的需要，具有广泛的应用价值。

靶标多肽的选择是构建质谱方法的关键所在[21]，当前研究多是通过对比生肉和熟肉制品寻找稳定蛋白，进而筛选出肉制品中更稳定的多肽[22-23]，比如Montowska等[23]利用蛋白质二维电泳图谱对比了猪、牛、鸡、驴、鸭、鹅的生肉与加热处理的熟肉，发现血清白蛋白、载脂蛋白B、热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、心型脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid binding protein，H-FABP）等加热前后有很大差别；Sarah等[24]对猪肉分别进行100 ℃煮沸30 min、121 ℃高温高压灭菌20 min以及4 ℃冷藏30 min，对比发现这3 种处理的猪肉蛋白有4 条多肽始终存在，可以作为猪肉稳定性特异标记物。在前期研究中发现经过高度加工的肉制品靶标多肽响应值和生肉相比明显下降[25]，但对加工环节靶标多肽稳定性的影响因素缺少系统性研究。

Giaretta等[26]研究发现牛肌红蛋白的稳定性良好，可以用作牛的特异性标记物。该蛋白共有154 个氨基酸残基，按照胰蛋白酶酶切位点可获得13 条多肽，覆盖了短肽链、中肽链、长肽链，同时既有牛的独有肽段（肽段7#），也有和猪、马等其他物种共同具有的肽段。

本实验在前期研究的基础上，以牛肌红蛋白酶解的多肽和来自于8 种不同蛋白的多肽为研究对象，探讨各条多肽在热加工环节中稳定性的变化规律，从加工方式、加工环节的化学因素中提取出对多肽稳定性影响较大的因素，包括加工方式（蒸煮、油炸、高压）、加热温度及时间、辅料（氯化钠添加量、辣椒素含量）、食品添加剂（以亚硝酸钠、山梨酸为代表的防腐剂）、金属离子（K+、Ca2+、Mg2+），研究各个因素对目标蛋白及多肽丰度的影响，为进一步选择热稳定性强的靶标多肽用于肉类的真实性鉴别提供理论依据，并为其他蛋白及多肽在研究热加工过程中的影响因素提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜牛肉由河北省福成五丰食品股份有限公司燕郊养殖分公司提供。

胰蛋白酶（测序级）、二硫苏糖醇（生化级） 美国Promega公司；碘乙酰胺（生化级） 美国Sigma公司；甲酸、乙酸、乙腈（均为色谱纯） 德国CNW科技公司；HLB固相萃取柱 美国Waters公司；尿素、硫脲、盐酸均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TSQ ultra EMR 液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）联用仪（配有电喷雾离子源、TraceFinder 4.1数据处理系统）美国Thermo Fisher公司；往返式水浴恒温摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司；Ultra-Turrax T25均质器德国IKA公司；20PR-520离心机 日本Hitachi公司；MLS-3020高压锅 日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉的处理

将牛肉切成4 cm×4 cm×2 cm规格的小块，对其进行蒸煮、油炸、高压和添加添加剂、辅料、金属离子处理。

蒸煮处理：取18 块切好的牛肉小块，随机分成6 组（第1组：60 ℃、5 min，第2组：100 ℃、5 min，第3～6组：80 ℃分别加热5、10、15、30 min），加热后取出，冷却至室温，每组3 个平行，进行加热时间和加热温度的单因素试验。

油炸处理：取3 块切好的牛肉小块，放入100 ℃恒温油炸锅内，油炸5 min后，取出冷却至室温。

高压处理：取3 块切好的牛肉小块，放入高压灭菌锅内，121 ℃、15 MPa高压处理15 min，取出冷却至室温。

添加添加剂处理：取18 块切好的牛肉小块，随机分成6 个组，加入山梨酸（添加量分别为20、45、75 mg/kg）和亚硝酸钠（添加量分别为10、30、50 mg/kg）。添加后静置30 min，均质待测。

添加辅料处理：取18 块切好的牛肉小块，随机分成6 个组，分别加入氯化钠（添加量分别为0.015、0.025、0.035 g/kg）和辣椒素（添加量分别为0.005、0.01、0.02 g/kg）。添加后静置30 min，均质待测。

添加金属离子处理：取27 块切好的牛肉小块，随机分成9 个组，每组3 个平行。金属离子为K+（KCl）、Ca2+（CaCl2）和Mg2+（MgCl2），均分别设置3 种不同浓度（10、50、250 mmol/L），添加后静置30 min，均质待测。

1.3.2 多肽的LC-MS/MS分析

参照前期研究中样品制备的前处理方法获得多肽，通过LC-MS/MS方法实现对特征性多肽的分析[27]。将牛肌红蛋白按照胰蛋白酶的理论酶解方式得到的13 条多肽链导入至Skyline软件中，从而得到每个多肽链的离子对信息，将离子对导入至LC-MS/MS中，对13 条多肽进行检测，通过对比离子保留时间、峰面积、峰形、离子比率等条件，筛选可用于LC-MS/MS分析的多肽离子信息。去掉5 种响应值低的多肽，本研究选择来自牛肌红蛋白的肽段1#～8#，以及来自于半乳凝集素-1、肌球蛋白轻链3、NAD-3-磷酸甘油脱氢酶、血清白蛋白、肌球蛋白-2、L-乳酸脱氢酶A链、肌球蛋白-1和α-1,4-葡聚糖磷酸化酶这8 种蛋白的肽段9#～18#作为研究对象。利用TraceFinder软件进行数据处理，对各个样品进行多重反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）扫描，详细的离子对信息见表1。

表1 牛肌红蛋白和其他蛋白的MRM采集参数Table 1 MRM MS instrument parameters for bovine myoglobin and other proteins

1.3.3 验证性实验

为了进一步验证所筛选的多肽在实际物种鉴别中的适用性，市购11 种不同的牛肉制品进行检测。

1.4 数据统计与分析

每批实验进行3 个平行，通过对比不同处理条件下每个多肽定量离子的峰面积，运用统计学分析手段进行数据分析，采用SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差分析及最小显著性差异法多重比较，以进行差异显著性分析（P＜0.05），实验结果均以平均值±标准差表示，最终筛选出对多肽影响比较显著的条件。

2 结果与分析

2.1 加热条件对多肽稳定性的影响

2.1.1 加热方式对多肽稳定性的影响

表2 蒸煮、油炸和高压对多肽稳定性的影响Table 2 Effect of boiling, frying, and high pressure processing on the stability of peptides

由表2可知，经不同加热方式处理后，肽段1#、肽段2#、肽段3#和肽段6#响应值均无显著变化（P＞0.05），说明在蒸煮、油炸和高压处理条件下这4 种多肽较稳定，且肽段2#在这3 种加热方式处理下响应值均较高，而肽段4#、肽段5#、肽段7#和肽段8#响应值在经这3 种加热方式处理后均具有显著性变化，说明这4 种多肽稳定性较弱。综上所述，不同加热方式对牛肌红蛋白中的多肽稳定性具有不同程度的影响，说明加热方式是影响多肽稳定的重要原因之一。

2.1.2 加热温度对多肽稳定性的影响

表3 不同温度加热5 min对多肽稳定性的影响Table 3 Effect of heating temperature on the stability of peptides

由表3 可知，经6 0、8 0 ℃和1 0 0 ℃处理5 m i n后，牛肌红蛋白酶解后的多肽响应值均无显著差异（P＞0.05），结果表明，不同加热温度处理对牛肌红蛋白中多肽稳定性均无影响。

2.1.3 加热时间对多肽稳定性的影响

表4 80 ℃条件下加热时间对多肽稳定性的影响Table 4 Effect of heating time on the stability of peptides at 80 ℃

由表4可知，在80 ℃条件下，5～30 min时，随着加热时间的延长，肽段1#、肽段2#、肽段3#、肽段4#、肽段5#、肽段7#和肽段8#响应值均无显著变化（P＞0.05），表明在80 ℃条件下不同加热时间对这7 种多肽的稳定性无影响，且肽段2#在80 ℃不同加热时间下响应值均较高。Wang Guiji等[28]对5 种肉类类型（猪肉、鸡肉、鸭肉、牛肉和羊肉）分别进行100 ℃煮沸3 min和5 min、150 ℃烧烤7 min和10 min以及180 ℃烧烤5 min和8 min，结果表明，加工温度和时间对多肽的稳定性无显著影响，本研究结果与其一致。

2.2 加工因子对多肽稳定性的影响

2.2.1 添加剂对多肽稳定性的影响

由表5和表6可知，添加不同剂量的山梨酸和亚硝酸钠后，肽段1#、肽段3#、肽段5#、肽段6#和肽段8#的响应值均无显著变化（P＞0.05），说明添加山梨酸和亚硝酸钠对这5 种多肽稳定性均无影响。添加不同剂量山梨酸（20、45、75 mg/kg）后，仅肽段7#的响应值发生显著性变化。添加不同剂量亚硝酸钠（10、30、50 mg/kg）后，仅肽段2#和肽段4#响应值发生不同程度变化。以上结果表明，山梨酸和亚硝酸钠并非是影响多肽稳定性的主要因素。

表5 山梨酸添加量对多肽稳定性的影响Table 5 Effect of sorbic acid content on the stability of peptides

表6 亚硝酸钠添加量对多肽稳定性的影响Table 6 Effect of sodium nitrite content on the stability of peptides

2.2.2 辅料对多肽稳定性的影响

表7 氯化钠添加量对多肽稳定性的影响Table 7 Effect of sodium chloride content on the stability of peptides

由表7 可知，添加不同剂量的氯化钠后，肽段2#、肽段3#、肽段4#和肽段6#响应值均无显著变化（P＞0.05），且肽段2#的响应值最高，说明肽段2#最稳定，而肽段1#、肽段5#、肽段7#和肽段8#响应值均发生变化，说明添加氯化钠对多肽稳定性影响较大。

由表8可知，添加不同剂量的辣椒素后，仅肽段3#和肽段7#响应值发生不同程度变化，肽段2#响应值最高且添加不同剂量辣椒素后无显著差异。以上结果表明，添加氯化钠可能是影响多肽稳定性的主要因素之一。

表8 辣椒素添加量对多肽稳定性的影响Table 8 Effect of capsaicin content on the stability of peptides

2.2.3 金属离子对多肽稳定性的影响

表9 K浓度对多肽稳定性的影响Table 9 Effect of K+content on the stability of peptides

表9 K浓度对多肽稳定性的影响Table 9 Effect of K+content on the stability of peptides

肽段编号 峰面积（×106）10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.723±0.230 1.593±0.045 1.607±0.036肽段2# 9.358±1.548 8.867±0.724 8.846±0.658肽段3# 1.583±0.179 1.479±0.003 1.410±0.111肽段4# 2.365±0.127 2.420±0.057 2.412±0.003肽段5# 1.310±0.057 1.222±0.062 1.000±0.313肽段6# 0.212±0.014 0.199±0.003 0.180±0.030肽段7# 0.531±0.040 0.544±0.008 0.476±0.016肽段8# 3.027±0.258 2.837±0.035 2.646±0.109

表10 Ca2浓度对多肽稳定性的影响Table 10 ffect of Ca2+content on the stability of peptides

表10 Ca2浓度对多肽稳定性的影响Table 10 ffect of Ca2+content on the stability of peptides

肽段编号 峰面积（×106）10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.508±0.072 1.356±0.156 1.494±0.219肽段2# 8.325±0.275 8.047±0.096 8.085± 0.160肽段3# 1.358±0.049 1.343±0.184 1.369± 0.201肽段4# 2.071±0.232 2.084±0.050 1.871± 0.196肽段5# 1.213±0.141a 0.990±0.065ab 0.781±0.028b肽段6# 0.183±0.002 0.173±0.015 0.173± 0.014肽段7# 0.472±0.010 0.504±0.056 0.472± 0.036肽段8# 2.587±0.084 2.508±0.455 2.524± 0.360

表11 Mg2浓度对多肽稳定性的影响Table 11 ffect of Mg2+content on the stability of peptides

表11 Mg2浓度对多肽稳定性的影响Table 11 ffect of Mg2+content on the stability of peptides

肽段编号 峰面积（×106）10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.507±0.122a 1.486±0.048a 1.770±0.041b肽段2# 7.746±0.822 7.971±0.431 9.441±0.227肽段3# 1.257±0.244 1.271±0.036 1.544±0.016肽段4# 2.107±0.089 1.949±0.236 2.491±0.110肽段5# 1.157±0.044a 1.058±0.028ab 1.002±0.021b肽段6# 0.184±0.016a 0.185±0.005a 0.228±0.002b肽段7# 0.452±0.043a 0.469±0.015a 0.538±0.007b肽段8# 2.478±0.425 2.667±0.114 2.906±0.017

由表9可知，添加不同浓度的KCl后，牛肌红蛋白中的多肽稳定性均无显著变化（P＞0.05）。添加不同浓度的CaCl2后，仅肽段5#响应值发生变化（表10）。添加不同浓度的MgCl2后，肽段1#、肽段5#、肽段6#和肽段7#响应值均发生显著性变化（表11），说明Mg2+影响这4 种多肽的稳定性；此外，肽段2#在不同金属离子（K+、Ca2+和Mg2+）浓度下的响应值均最高且无显著性变化，说明稳定性较好。综上，Mg2+可能是影响多肽稳定性的主要因素之一。

2.3 不同因素对来源于其他蛋白的多肽稳定性的影响

上述研究结果表明，加热方式、氯化钠和Mg2+显著影响牛肌红蛋白中多肽的稳定性，因此为了验证加热方式、辅料、添加剂和Mg2+对多肽热稳定性的影响规律，本实验选用来源于其他蛋白（表1）的多肽再次研究加工过程中重要因素（加热方式、氯化钠和Mg2+）对多肽的影响。

2.3.1 加热方式对其他来源多肽稳定性的影响

表12 蒸煮、油炸和高压对其他来源多肽稳定性的影响Table 12 Effect of boiling, frying, and high pressure processing on the stability of peptides from other proteins

由表12可知，经蒸煮（100 ℃）、油炸和高压3 种加热方式处理后，肽段9#、肽段11#、肽段12#、肽段15#、肽段16#和肽段17#响应值发生显著性变化，说明这6 种多肽在蒸煮、油炸和高压3 种处理条件下的稳定性较弱，而肽段10#、肽段13#、肽段14#和肽段18#响应值未发生显著变化（P＞0.05），说明这4 种多肽较稳定，且肌球蛋白-2的肽段13#在这3 种加热方式处理下响应值均较高，说明肽段13#稳定性最强。综上所述，对来源于不同蛋白的多肽而言，加热方式也是影响其稳定性的重要因素。

2.3.2 氯化钠对其他来源多肽稳定性的影响

由表13可知，添加不同剂量的氯化钠后，肽段10#、肽段11#、肽段13#、肽段16#和肽段18#响应值均无显著变化（P＞0.05），且肌球蛋白-2的肽段13#响应值较高，说明肌球蛋白-2的肽段13#最稳定，而肽段9#、肽段12#、肽段14#、肽段15#和肽段17#响应值均发生显著变化，说明添加氯化钠影响多肽稳定性。结果表明，添加氯化钠也是影响多肽稳定性的主要因素之一。

表13 氯化钠添加量对其他来源多肽稳定性的影响Table 13 Effect of sodium chloride content on the stability of peptides from other proteins

2.3.3 Mg2+浓度对其他来源多肽稳定性的影响

表14 Mg2＋浓度对其他来源多肽稳定性的影响Table 14 Effect of Mg2+content on the stability of peptides from other proteins

由表14可知，添加不同剂量的MgCl2后，肽段11#、肽段14#、肽段15#、肽段16#和肽段18#响应值均发生显著性变化，说明Mg2+影响多肽稳定性。由上述结果可知，对来源于不同蛋白的多肽而言，加热方式、氯化钠和Mg2+显著影响多肽的稳定性，肌球蛋白-2的肽段13#在3 种加热方式、添加氯化钠及Mg2+条件下的响应值均最高，且在相同处理方式不同组别之间无显著差异，说明肽段13#易被质谱检测，响应值最高，稳定性高，且是独有多肽（表1），Orduna等[29]建立了一种高分辨率轨道离子阱质谱方法来确定肉类真伪，同样发现肌球蛋白-2可用于肉类的真实性鉴定，但研究对象仅限于生肉样品。本研究通过热加工过程处理后的结果发现来源于肌球蛋白-2的肽段13#用于肉制品真实性鉴别的优势也更为显著。

2.4 多肽的物理化学性质

牛肌红蛋白中的多肽（肽段1#～8#）和来源于不同蛋白的多肽（肽段9#～18#）的物化性质见表15。借助多肽计算器（http://www.chinapeptides.com/tool.aspx）对多肽分析，序列分析显示出这些多肽的分子质量、等电点、净电荷和亲水残基比例存在差异，但这些差异并不是影响多肽响应值较高的主要因素。肽段2#是疏水性氨基酸的疏水性多肽，但本研究表明肽段2#易被质谱系统检测，具有较强的响应值且非常稳定，这可能与氨基酸组成、多肽结构及质谱系统检测参数有关。来源于肌球蛋白-2的肽段13#是亲水性氨基酸组成的亲水性多肽，其溶解性较好，经热加工过程等多种因素处理后易被质谱系统检测，其响应值均较高，稳定性强，这可能取决于多肽结构。据报道肉经腌制、蒸煮、烧烤、干燥、烟熏、杀菌等工艺处理后，会导致蛋白质变性，其构象、分子作用力、三维结构等发生一系列的变化，但肽段的氨基酸序列（蛋白质的一级结构）受影响较小[30-31]，考虑到开展真实性鉴别，需要选择物种的特异性多肽，结合表2可知，来源于肌球蛋白-2的肽段13#作为肉制品样品掺假检测所选的特征多肽优势更为显著。

表15 多肽的物理化学性质Table 15 Physicochemical properties of peptides

2.5 真实性鉴别中的应用

采用本研究方法对11 种类型的市售牛肉制品样品进行鉴别（表16），其中5号样品五香牛肉干的主成分虽然标称是牛肉，但所有多肽都未检出，可见此样品为掺假样品，其余的10 件产品均含有牛肉成分。对来源于牛肌红蛋白的肽段1#～8#而言，其余10 件牛肉制品样品的肽段1#、2#、3#和8#响应值较高，且肽段2#的响应值相对最高；对来源于不同蛋白的肽段9#～8#而言，其余10 件牛肉制品样品的肽段13#响应值总体考虑相对较高；因此，本研究结果选择稳定性较强的靶标多肽（牛肌红蛋白中肽段2#和来源于肌球蛋白-2的肽段13#）用于牛肉制品真实性鉴别中具有广阔的应用价值。

表16 选择的肽段在市售牛肉制品样品的鉴别应用Table 16 Application of selected peptides in the identification of commercially available beef products in markets

3 结 论

本研究针对牛肌红蛋白热加工过程中多肽稳定性影响因素进行初步研究，探讨加热条件和加工因子对多肽稳定性的影响规律，同时对市售牛肉制品进行真实性鉴别。通过研究加热方式（蒸煮、油炸、高压）、加热温度及时间、辅料（氯化钠添加量、辣椒素含量）、食品添加剂（防腐剂代表亚硝酸钠、山梨酸）、金属离子（K+、Ca2+、Mg2+）对各条多肽稳定性的影响，结果表明：加热方式、氯化钠和Mg2+是影响多肽稳定性较显著的重要因素，加热温度、加热时间、添加剂、辣椒素和K+、Ca2+对多肽稳定性的影响较小；在相同处理条件下，通过对来源于不同蛋白的多肽的验证实验结果可知，加热方式、氯化钠和Mg2+添加量也均显著影响多肽的稳定性。经热加工等不同条件处理后，结果发现牛肌红蛋白中肽段2#和来源于肌球蛋白-2的肽段13#易被质谱系统检测，且均具有响应较强的峰值，非常稳定。综合考虑，肽段13#作为肉制品样品掺假检测所选的特征多肽优势更为显著。本研究探讨了多肽在热加工环节中稳定性的影响因素，为肉制品加工过程中热稳定多肽的选择提供了理论依据，进而为深加工肉制品真实性鉴别提供了技术支持。