宁亚维，苏 丹，付浴男，刘杨柳，王志新，贾英民,

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

为了防止食品腐败变质，食品加工过程中通常通过添加防腐剂进行防腐保鲜，其中最常用的为化学防腐剂。但随着人们对食品安全逐渐重视，化学防腐剂的安全性受到质疑，天然防腐剂受到青睐[1-2]。目前研究较多的天然防腐剂主要包括各类植物提取物（如植物精油、迷迭香、大蒜素等）和抗菌肽[3-4]。多数植物提取物如精油和大蒜素等由于添加后会影响食品本身的风味而需要进行包埋等修饰，这无疑提高了生产成本。抗菌肽主要由微生物发酵产生，具有生产周期短、成本低等优势，在食品防腐领域具有较高的应用潜力。抗菌肽brevilaterin是由侧孢短芽孢杆菌产生的一种小分子肽，具有抑菌谱广、热稳定性好等优点[5]。研究发现brevilaterin对革兰氏阴性菌的抑菌能力较阳性菌弱，单独使用时存在用量大的问题，因此在食品中要实现广谱抑菌则需要增加使用剂量，导致成本增加。

具有协同作用的防腐剂联合使用，可提高防腐剂的抗菌活性，降低单一防腐剂的使用量[6]。为了降低抗菌肽在食品中的使用量，本课题组对多种天然防腐剂进行了筛选，发现柠檬酸与brevilaterin联用对大肠杆菌（Escherichia coli）具有协同抑菌效应，联合使用可增强其抑菌活性[7]。柠檬酸在食品中主要作为酸味调节剂使用，但是研究也发现其可以作为协同抑菌剂来提高Nisin的抑菌活性[8-9]。Campion等[10]发现柠檬酸与Nisin复配使用可有效降低婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的数量。Oladunjoye等[11]研究表明柠檬酸、Nisin联合使用对番茄切片中的单核细胞增生李斯特菌具有协同控制作用。柠檬酸与抗菌肽联用可发挥双功能性，即酸味调节和抑菌作用。因此，抗菌肽和柠檬酸联合使用在食品中具有较好的应用前景，然而两者联用的抑菌机理尚不明确。

大肠杆菌是一种常见的食源性致病菌，不仅会造成食品腐败变质，还会通过污染食品感染人类，引起食源性疾病。据美国疾病控制与预防中心报道，产志贺毒素的大肠杆菌每年导致超过26.5万人患病；2016年，美国报告了5 441 例产志贺毒素的大肠埃希氏菌感染病例，包括2 323 例O157和3 104 例非O157病例，且与2015年相比非O157感染率增加了15%[12]。因此，控制食品中的食源性致病菌——大肠杆菌具有重要意义。

本研究以食源性致病菌大肠杆菌为指示菌，通过时间-杀菌曲线考察了brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌的协同抑菌效应，从细胞膜损伤（如跨膜电势、膜完整性、菌体超微结构），菌体蛋白质合成以及对细菌DNA的影响三方面研究了brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌的协同抑菌机理，以期为抗菌肽brevilaterin与柠檬酸在食品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株与试剂

brevilaterin由河北科技大学食品生物技术与安全实验室制备[13]；大肠杆菌ATCC 44752由河北科技大学食品生物技术与安全实验室保藏。

柠檬酸 天津永大化学试剂有限公司；DiSC3(5)美国Sigma公司；LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒 美国Thermo Fisher Scientific公司；低分子质量蛋白质Marker、DNA Ladder 北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技有限公司；琼脂糖G-10 上海玉博生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Evolution 220型紫外分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；SepctraMax Plus 384型酶标仪美国Molecular Devices公司；F-7000-FL型荧光分光光度计、H-7650型透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；Accuri C6 plus型流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；BX53型荧光显微镜 日本奥林巴斯株式会社；Gel Doc XR+型凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 时间-杀菌曲线绘制

将生长至对数期的大肠杆菌悬液与不同抑菌剂组混合，使菌悬液终浓度为5×105CFU/mL，brevilaterin终浓度分别为160 AU/mL（最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC））、40 AU/mL（1/4 MIC），柠檬酸终质量浓度分别为1.25 mg/mL（MIC）、0.312 5 mg/mL（1/4 MIC），联用组brevilaterin（1/4 MIC）+柠檬酸（1/4 MIC），以质量分数0.85%生理盐水作为空白对照。将各处理组置于37 ℃孵育一定时间后，取出涂布平板并于37 ℃培养18 h后进行活菌菌落计数。

1.3.2 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌跨膜电势的影响

参考Lee等[14]的方法并进行适当修改。将大肠杆菌培养至对数生长期，用5 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（含10 mmol/L葡萄糖、100 mmol/L氯化钾，pH 7.2）清洗并重悬为2×108CFU/mL的菌悬液。将膜电位探针DiSC3(5)添加到菌悬液中（终浓度为1 μmol/L）于30 ℃避光孵育15 min。在比色皿中加入菌悬液与等体积各浓度的抑菌剂（brevilaterin（1/4 MIC）组与MIC组，柠檬酸（1/4 MIC）组与MIC组，以及联用组brevilaterin（1/4 MIC）+柠檬酸（1/4 MIC）），以无菌水作为空白对照，以缬氨霉素（valinomycin，Val）为阳性对照，尼日利亚菌素（nigericin，Nig）为阴性对照，终浓度均为10 μmol/L。利用荧光分光光度计进行扫描，其中激发波长为650 nm，发射波长为672 nm。

1.3.3 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌细胞膜完整性的影响

参考Wang Yao等[15]的方法并进行适当修改。将培养至对数生长期的大肠杆菌用生理盐水清洗、重悬制备为浓度为2×108CFU/mL的菌悬液。将等体积的菌悬液与不同浓度抑菌剂混合。在37 ℃条件下孵育1 h，然后用生理盐水清洗、重悬。以生理盐水作为阴性对照，以体积分数70%异丙醇作为阳性对照。向上述菌悬液中加入SYTO 9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）（终浓度为2 μmol/L）并于30 ℃条件下避光孵育15 min。最后通过生理盐水清洗、重悬后，分别采用流式细胞仪和荧光显微镜对染色细胞进行计数分析与拍照观察。

1.3.4 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌超微结构的影响

参考Liu Hongxia等[16]的方法并进行适当修改。将培养至对数期的大肠杆菌用0.1 mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗、重悬制备菌悬液，然后分别向菌悬液（终浓度为2×108CFU/mL）中加入各组抑菌剂，以PBS作为空白对照。37 ℃下培养1 h后，用PBS清洗两遍，然后用体积分数4%戊二醛4 ℃固定过夜。再用体积分数1%锇酸在4 ℃固定4 h，不同体积分数（30%、50%、70%、80%、90%）的丙酮逐级脱水，再用无水丙酮置换两次。用包埋剂包埋、聚合后进行超薄切片，采用醋酸双氧铀进行染色后，采用TEM观察。

1.3.5 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌蛋白质合成的影响

参考Ning Houqi等[17]的方法并进行适当修改。将培养至对数生长期的大肠杆菌用生理盐水清洗、重悬。将菌悬液与抑菌剂混合使其终浓度为108CFU/mL，并于37 ℃条件下培养1 h。用生理盐水清洗、重悬至300 μL，加入4×蛋白上样缓冲液900 μL，在100 ℃沸水中加热5 min后，放至室温离心后备用。制备凝胶（10%的分离胶与4%的浓缩胶），安装好电泳装置后，于上样孔中加样10 μL，调节电压至80 V开始十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），待溴酚蓝进入分离胶后120 V跑至胶底。将胶块放置于染色液（考马斯亮蓝G250 1 g/L、45%（体积分数，下同）甲醇、10%冰醋酸、45%蒸馏水）中摇床染色20 min后，放入脱色液（10%甲醇、10%冰醋酸、80%蒸馏水）中进行摇床脱色，直至条带清晰后使用凝胶成像仪拍照记录结果。

1.3.6 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌细菌DNA的影响

采用DNA试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA，使用超微量紫外分光光度计测定所提DNA的质量浓度（62.4 µg/mL）和纯度（OD260nm/OD280nm＝1.83）。制备质量分数0.8%的琼脂糖凝胶，其中加入4S Red Plus核酸染色剂（终剂量为0.1 µL/mL）。将DNA与各浓度抑菌剂混合（DNA终质量浓度为31 µg/mL），在37 ℃下水浴30 min后，进行琼脂糖凝胶电泳并使用凝胶成像仪拍照观察。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复3 次取其平均值。采用Origin 8.0软件通过单因素方差分析法对实验结果进行统计分析并作图。

2 结果与分析

2.1 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌的时间-杀菌曲线

通过时间-杀菌曲线研究了brevilaterin与柠檬酸联用组合的抑菌动力学，从图1可以看出，brevilaterin、柠檬酸的MIC组和联用组brevilaterin（1/4 MIC）+柠檬酸（1/4 MIC）在24 h内均呈现抑菌效果，且联用组较brevilaterin（1/4 MIC）与柠檬酸（1/4 MIC）单独使用的菌落数有明显下降，结果证实brevilaterin（1/4 MIC）与柠檬酸（1/4 MIC）联用具有协同抑菌效果。

图1 brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌的时间-杀菌曲线Fig. 1 Time-killing curve of brevilaterin in combination with citric acid against E. coli

2.2 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌细胞跨膜电势的影响

DiSC3(5)是一种膜电位敏感染料，能够在完整的极化细胞膜中累积，处于自猝灭状态；当膜电位被破坏时，染料被释放到介质中，DiSC3(5)荧光强度增加[18-19]。因此采用DiSC3(5)考察大肠杆菌细胞膜电势的变化。如图2所示，阴性对照组（Nig）、空白对照组荧光强度无明显变化，而阳性对照组（Val）可有效提高钾离子的扩散速率，从而消散膜电位，使荧光强度增加。brevilaterin（1/4 MIC）组荧光强度无明显变化，brevilaterin（MIC）组荧光强度明显增加（从230增加至320左右），说明其会消散膜电位。1/4 MIC柠檬酸和MIC柠檬酸组荧光强度均增加，但两者无显著差异，表明1/4 MIC和MIC柠檬酸均可以导致细胞膜电势消散，且1/4 MIC和MIC柠檬酸对细胞膜电势的消散程度无显著差异。联用组brevilaterin（1/4 MIC）+柠檬酸（1/4 MIC）的荧光强度随时间的延长不断增强，其荧光强度明显高于brevilaterin（MIC）组与柠檬酸（MIC）组的荧光强度。因此可推测，brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌膜电势有协同消散作用。

图2 brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌细胞跨膜电势的影响Fig. 2 Influence of brevilaterin combined with citric acid on transmembrane potential of E. coli

2.3 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌细胞膜完整性的影响

图3 brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌细胞膜完整性影响的流式细胞图Fig. 3 Effect of brevilatein combined with citric acid on the membrane integrity of E. coli determined by flow cytometry

利用SYTO 9和PI荧光探针研究brevilaterin与柠檬酸对细胞膜完整性的影响[20-21]。SYTO 9探针可以标记所有细菌，而PI只能标记细胞膜受损的细菌[22]；当两种染料同时存在时，PI会与SYTO 9发生竞争性结合导致SYTO 9染色荧光的减弱。如图3所示，空白对照组膜受损率为3.3%，brevilaterin（1/4 MIC）组的膜受损率达到了66.7%，brevilaterin（MIC）组的膜受损率较高，为98.1%；柠檬酸（1/4 MIC）组的膜受损率20.7%，柠檬酸（MIC）组的膜受损率为60.0%，联合使用组的膜受损率高达99.5%。因此，上述结果表明brevilaterin（MIC）基本能够破坏全部细胞的膜完整性，柠檬酸（MIC）仅能破坏部分细胞的膜完整性，联用组的膜受损率高于二者单独作用，说明brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌的膜完整性具有协同破坏作用。

从图4可以观察到，未经抑菌剂处理的对照组细胞仅被SYTO 9染色，发出绿色荧光，表明细胞膜完整，而经过brevilaterin（1/4 MIC）组处理后，60%以上细胞发出红色荧光；经过brevilaterin（MIC）组处理后，几乎所有细胞都发出橙红色荧光。经过柠檬酸（1/4 MIC）组处理后，大多数细胞为绿色，而经过柠檬酸（MIC）组处理后，50%以上的细胞呈现红色，表明柠檬酸处理后的细胞膜受损率较brevilaterin（MIC）组小。而联用组brevilaterin（1/4 MIC）+柠檬酸（1/4 MIC）细胞几乎全部发出橙红色荧光，说明几乎所有的细胞膜完整性受到破坏，上述结果与流式细胞仪检测结果一致。

图4 brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌细胞膜完整性影响的荧光显微图Fig. 4 Effect of brevilatein combined with citric acid on the membrane integrity of E. coli observed by fluorescence microscopy

2.4 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌超微结构的影响

通过TEM观察brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌菌体形态变化的影响，结果如图5所示，空白对照组菌体形态完好、内容物完整；brevilaterin（MIC）组的细胞发生形变、质壁分离、细胞内容物泄漏等变化[23]；柠檬酸（MIC）组细胞膜边缘模糊且细胞内容物泄漏，表明brevilaterin和柠檬酸均可以破坏细胞的超微结构。此外，brevilaterin（1/4 MIC）组部分细胞受损（与时间-杀菌曲线显示的部分抑菌效果一致），细胞内局部出现空腔，柠檬酸（1/4 MIC）组无显著影响，但联用组brevilaterin（1/4 MIC）+柠檬酸（1/4 MIC）处理后细胞发生形变，菌体内出现空洞，表明brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌超微结构有协同破坏效应。

图5 brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌超微结构影响的TEM图Fig. 5 Effect of brevilatein combined with citric acid on the ultrastructure of E. coli examined by TEM

2.5 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌蛋白质合成的影响

蛋白质在细胞代谢与物质合成中发挥关键作用，因此考察了brevilaterin与柠檬酸对蛋白质表达的影响。通过SDS-PAGE分析考察大肠杆菌的蛋白质条带变化，如图6所示，brevilaterin（MIC）组（泳道6）在分子质量31 kDa附近有一个条带颜色加深（箭头处），其他条带均无明显变化，可能是由于高浓度的brevilaterin促进了此分子质量蛋白质的合成。上述结果表明brevilaterin、柠檬酸对蛋白质表达无显著影响。

图6 brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌蛋白质合成影响的SDS-PAG图Fig. 6 Effect of brevilatein combined with citric acid on protein synthesis in E. coli evaluated by SDS-PAGE

2.6 brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌DNA的影响

DNA是最重要的遗传物质之一，DNA的损伤会影响基因的表达，导致酶和受体蛋白质等合成受阻，最终导致细胞死亡[24]。从图7可以看出，空白对照组的DNA条带亮度最强，brevilaterin（1/4 MIC）和brevilaterin（MIC）组条带亮度与对照组相比轻微减弱；柠檬酸（1/4 MIC）组DNA条带亮度明显降低，柠檬酸（MIC）处理组的DNA条带弥散消失；联用组的DNA条带亮度较brevilaterin（1/4 MIC）、柠檬酸（1/4 MIC）显著降低。结果表明，柠檬酸对大肠杆菌菌体DNA具有较强的降解作用，brevilaterin和柠檬酸联用组对DNA具有协同降解作用。

图7 brevilaterin与柠檬酸联用对大肠杆菌 DNA影响的凝胶阻滞图Fig. 7 Effect of brevilatein combined with citric acid on DNA of E. coli evaluated by gel retardation

3 讨 论

近年来，抗菌肽作为天然防腐剂愈来愈受到人们青睐，且天然防腐剂之间复配使用因可有效提高抗菌活性，降低使用量而受到人们关注。Khorsandi等[25]研究发现Nisin与天然防腐剂联用可有效延长香肠货架期；Shi Ce等[26]研究发现Nisin与肉桂醛联用对巴氏杀菌奶中的金黄色葡萄球菌有很好的协同抑菌效果；Najjar等[27]研究发现聚赖氨酸与Nisin A联用可以有效抑制人体口腔中的变形链球菌的生长。Jia Shiliang等[28]发现聚赖氨酸与低温贮藏可延缓太平洋白虾变质。本研究所考察的brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌具有较好的协同抑制作用，且联用可降低brevilaterin与柠檬酸单独使用的剂量，在食品防腐中具有较大的应用潜力。

目前，关于抗菌肽的机理研究已有大量报道，抗菌肽主要作用于微生物细胞膜，如在细胞膜上形成离子通道、跨膜孔，造成膜大面积破裂，最终导致微生物细胞的裂解；同时，抗菌肽也可能会破坏靶向DNA和伴侣蛋白，改变细胞质膜隔膜的形成，抑制细胞壁合成，减少核酸合成，抑制蛋白质合成或抑制酶的活性[29-30]。基于此，本实验通过细胞壁膜、蛋白质合成和核酸合成对brevilaterin的抑菌机理进行研究。通过细菌跨膜电势、细胞膜通透性实验和菌体超微结构观察分析发现抗菌肽brevilaterin、柠檬酸均对大肠杆菌细胞膜有破坏作用；通过对菌体DNA影响的研究发现brevilaterin、柠檬酸对菌体DNA有降解作用。同时本研究发现，brevilaterin与柠檬酸相比对大肠杆菌膜的破坏性较强，推测可能与其作用方式有关，即抗菌肽在细胞膜表面形成跨膜孔增大了细胞膜的通透性。

综上，brevilaterin与柠檬酸对大肠杆菌具有协同抑菌作用，可以通过消散细胞跨膜电势，破坏细胞膜完整性，造成菌体DNA降解和细胞内容物泄漏。本研究为brevilaterin与柠檬酸复配组合在食品防腐中的应用中提供了理论参考。