单雅楠，王舒宁，董柏茹，吴洁

锦州医科大学公共卫生学院，辽宁锦州121001

多溴联苯醚(PBDEs)是一类具有阻燃特性的化学物，广泛用于家具、塑料、电子产品、油漆、纺织品以及建筑材料中。由于非共价结合于其他材料，PBDEs容易释放入环境，经食物链进入生物体内而在富含脂质的组织中长期蓄积，在人体内的半衰期可达2～7年[1,2]。由于PBDEs兼具内分泌干扰作用和神经毒性，其生物累积在整个生命进程中的多种结局备受关注[3]。尽管与低溴同系物相比，十溴联苯醚(BDE-209)通过血脑屏障的能力较差，但发育期暴露所致学习与记忆缺陷、胆碱能系统紊乱和突触发育关键蛋白改变均已在动物实验证实[4～6]。血脑屏障的功能首要在于脑微血管内皮细胞间的紧密连接，紧密连接蛋白claudins、occludin均是紧密连接的组成成分。研究表明，PBDEs结构与毒性类似物多氯联苯可引起小鼠脑紧密连接蛋白表达改变，破坏脑微血管内皮细胞完整性[7]，从而促进其中枢神经系统毒性；但是，PBDEs对血脑屏障的作用目前尚不清楚。2018年3～9月，我们采用脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养建立血脑屏障体外模型，观察BDE-209对血脑屏障通透性的影响，以探讨PBDEs可能的神经毒性机制。

1 材料与方法

1.1 材料 BDE-209(99%，Alfa Aesar)；小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3(ATCC，CRL-2299)，DMEM高糖培养液、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA (Gibco)；鼠尾胶原蛋白Ⅰ型(杭州欣友生物)，辣根过氧化物酶(HRP，Sigma)，TMB显色液(碧云天生物)；兔抗occludin抗体(Zymed，Thermo)，小鼠抗GAPDH抗体(Proteintech)，BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/小鼠二抗(北京鼎国)。酶标仪(Bio Tek)，ERS-2电阻仪(Millipore)，Transwell(孔径0.4 μm，Corning)，低温高速离心机(Sigma)，超声波细胞粉碎机(宁波新芝)，垂直电泳槽、转印槽(北京凯元信瑞)，Tanon 5200全自动化学发光成像分析系统(上海天能)。

1.2 血脑屏障体外模型的建立

1.2.1 bEnd.3细胞培养 按照ATCC推荐的培养方法进行，培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次，消化液为0.25%胰酶与0.03%EDTA(W/V)。

1.2.2 星形胶质细胞原代培养与传代 取出生48 h内的健康Wistar胎鼠(锦州医科大学实验动物中心)，乙醇浸泡消毒后取脑；解剖显微镜下取双侧大脑皮质，冰上D-Hanks液洗2次；剪碎后加入0.125%胰酶，于37 ℃恒温水浴中消化15 min；以1 500 r/min离心8 min，沉淀中加入含10%马血清的DMEM培养液；200目筛网过滤，将悬液接种至细胞培养皿，于37 ℃、5% CO2培养箱培养；每2 d全量换液，6～7 d传代。取第3代细胞，用免疫荧光细胞化学法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定星形胶质细胞，结果显示纯度达90%以上，可用于非接触共培养模型的构建。

1.2.3 共培养模型构建 用鼠尾胶原包被Transwell，以0.006 mol/L乙酸稀释鼠尾胶原至100 μg/mL，包被浓度6～10 μg/cm2(12孔，1.12 cm2，80～100 μL)；超净台内室温放置1 h，PBS洗3次直接使用(单层内皮细胞)。星形胶质细胞接种于下室3 d后，将bEnd.3细胞以2×105/mL接种于鼠尾胶原包被的Transwell(PET膜，孔径0.4 μm，12孔)嵌套中；每天观察细胞融合状态，融合后的内皮-胶质细胞非接触共培养模型即为血脑屏障体外模型。

1.3 血脑屏障体外模型的评价 采用ERS电阻仪测定单层内皮细胞及其与胶质细胞非接触共培养模型的跨内皮细胞电阻值(TEER)，以无细胞的培养池作为对照，测定培养第2、3、4、5天时内皮细胞TEER。TEER(Ω·cm2)=(TEER测定-TEER对照)×S(膜面积)。TEER在100～140 Ω·cm2，即可判断为模型构建成功[8,9]。培养不同时间内皮细胞TEER差异有统计学意义(F=87.546，P<0.001)，第4天TEER值可达到110 Ω·cm2。因第3天时非接触共培养模型与单层内皮细胞TEER即出现显著差异(t=5.170，P=0.002)，故后续实验选择第3天即接种后48 h给予处理因素并作用24 h。见图1。

注：与同类细胞第2天比较，*P<0.05；与单层内皮细胞同时点比较，#P<0.05。

1.4 BDE-209作用浓度的确定 采用CCK-8检测bEnd.3细胞活性。将bEnd.3细胞悬液接种于96孔板，(1～2)×104/孔(100 μL)，每组4个复孔，37 ℃培养48 h；加入0、10、25、50、100 μmol/L的BDE-209，继续培养24 h；吸除培养液，加入含10% CCK-8的DMEM，37 ℃培养2 h，测定450 nm波长处测定吸光度(A450)值。细胞活性(%)=实验孔A450/对照孔A450×100%。0、10、25、50、100 μmol/L的BDE-209作用24 h，bEnd.3细胞活性分别为100%±0.95%、97.85%±1.40%、92.90%±1.80%、84.25%±2.13%、65.38%±1.76%。100 μmol/L时细胞活性低于80%，故后续实验以50 μmol/L作为BDE-209最大剂量。

1.5 BDE-209染毒后血脑屏障体外模型通透性观察 将0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用于血脑屏障体外模型中的bEnd.3细胞24 h，然后从不同指标观察其通透性变化。

1.5.1 TEER 采用ERS电阻仪测定TEER，方法参照1.3。

1.5.2 渗透情况 采用HRP渗透实验。将含2 μg/mL HRP的DMEM培养液加入Transwell嵌套内，培养板孔内添加不含示踪剂的DMEM培养液，保持细胞内外液面相平；60 min后从培养板孔中取50 μL液体接种96孔板，每孔加100 μL TMB底物显色30 min；加1 mol/L H2SO4终止反应后，在450 nm波长处测定A450。HRP渗透=实验孔A450/对照孔A450。HRP渗透越多，表示血脑屏障通透性越高。

1.5.3 紧密连接蛋白 采用Western blotting法。提取细胞全蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量；将样品调至相同浓度，95 ℃煮沸5 min变性，冰上冷却。取总量相同蛋白，在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白；湿转至PVDF膜(Millipore，0.45 μm)，5%脱脂奶粉-TBST封闭1 h；加入兔抗occludin一抗(1∶1 000)或小鼠抗GAPDH一抗(1∶5 000)，4 ℃过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)，室温孵育1 h；TBST洗膜10 min×3次，ECL发光法显影。采用Image J软件分析灰度值，以目的蛋白与内参灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 BDE-209对血脑屏障体外模型TEER的影响 0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用24 h，血脑屏障体外模型TEER分别为(119.840±3.542)、(105.280±4.089)、( 91.280±4.967)、(72.240±1.940)Ω·cm2。随着BDE-209浓度增加，TEER逐渐下降(F=114.232，P<0.001)。

2.2 BDE-209对血脑屏障体外模型HRP渗透的影响 0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用24 h，血脑屏障体外模型HRP渗透分别为1.030±0.034、1.351±0.042、1.871±0.032、2.676±0.063。随着BDE-209浓度增加，HRP渗透逐渐增多(F=103.625，P<0.001)。

2.3 BDE-209对血脑屏障体外模型中bEnd.3细胞occludin蛋白表达的影响 0、10、25、50 μmol/L的BDE-209作用24 h，血脑屏障体外模型中bEnd.3细胞occludin蛋白表达量分别为0.572±0.064、 0.478±0.059、0.321±0.067、0.268±0.039。随着BDE-209浓度增加，occludin蛋白表达量逐渐降低(F=17.291，P=0.001)。

3 讨论

血脑屏障是由脑毛细血管内皮细胞彼此紧密相连，同时与周细胞和星形胶质细胞相互作用形成的屏障系统，控制营养物质转运和中枢神经系统内环境稳态[10]。研究表明，PBDEs在脊椎动物脑中蓄积最高的为鱼类，其次是青蛙，哺乳动物和鸟类脑中蓄积相对较低，这可能与脊椎动物物种血脑屏障的演变有关[11]。但宠物猫脑中呈现较高浓度的BDE-209和BDE-207，提示其可通过血脑屏障[12]。

脑微血管内皮细胞间的紧密连接是血脑屏障的功能基础和特征结构，常用跨膜电阻作为紧密连接程度的主要指标[13]。星形胶质细胞终足覆盖约99%血管表面，对维持微血管内皮细胞的特异性和血脑屏障的完整性起到重要作用[14]。脑微血管内皮细胞-星形胶质细胞非接触共培养模型中，两种细胞的相互作用能增强前者胞间紧密连接和转运体的表达，诱导细胞极性的产生，促进其表现型更接近于体内状态；与单层内皮细胞相比，共培养模型能观察到高跨膜电阻和通透性指示剂的低渗透性[15]。永生化小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3具有脑微血管内皮细胞的屏障特性，可表达高浓度紧密连接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1[16]。本研究采用bEnd.3与大鼠星形胶质细胞共培养建立的血脑屏障体外模型，在第4天TEER值可达100 Ω·cm2以上，屏障特性趋于稳定，模型建立成功。

脑血管内皮细胞间通过紧密连接和黏附连接严格限制了细胞旁运输[14]。紧密连接蛋白主要包括跨膜蛋白(claudins、occludin、连接黏附分子JAMs)和与细胞骨架联动的胞质蛋白(闭锁小带ZOs、扣带蛋白cingulin)。occludin是含有4个跨膜结构域的整合蛋白，主要在上皮细胞及中枢神经系统血管内皮细胞中表达；其在细胞之间形成同源连接，控制细胞间的通透性。occludin缺失的小鼠血脑屏障形态结构正常，但脑中可出现钙化现象，提示occludin可能参与血脑屏障对钙离子通透性的调控[17]。与PBDEs构效特征相似的多氯联苯，可引起紧密连接蛋白claudin-5和occludin的减少和再分布，从而改变血脑屏障完整性[18]。本研究结果表明，BDE-209可使bEnd.3与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型HRP渗透增多，TEER值下降，occludin蛋白表达水平下调，提示BDE-209可致血脑屏障紧密连接破坏而增高其通透性。

血脑屏障完整性或通透性改变参与多种神经系统疾病病理进程，对于生前和生后发育期血脑屏障结构或功能尚不完善的特点，一方面促进BDE-209进入脑实质，另一方面可能由此造成对血脑屏障的损伤而加重其神经毒性，但具体损伤机制还需进一步研究。