韩亚伟，崔冉亮，李悦国

天津医科大学肿瘤医院 国家肿瘤临床医学研究中心 天津市肿瘤防治重点实验室 天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年升高[1]。尽管在防治方面已取得很大改善，但肝癌患者的长期生存情况仍然不佳[2]。分子靶向治疗是肿瘤治疗的新手段，在分子水平研究肝癌的发病机制有助于寻找相应靶标，提高肝癌的诊治效果[3,4]。非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA，近年研究表明其在多种生理病理过程中发挥重要调控作用[5,6]。其中，长链非编码RNA(lncRNA)异常表达可影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭等生物学功能，从而促进或抑制肿瘤的形成[7,8]。研究表明，lncRNA在细胞中核质分布不同，其发挥作用的机制不同；PRC2是一种多梳家族蛋白，主要分布在细胞核中，具有组蛋白甲基转移酶活性，而SUZ12、EZH2在PRC2功能发挥中起重要作用。本课题组前期研究表明lncRNA SCARNA10能够促进肝纤维化进展[9]，且有报道发现其在肺癌和乳腺癌等恶性肿瘤组织中异常表达[10,11]。2019年8月～2020年6月，我们观察了SCARNA10在肝癌细胞中的表达及对细胞增殖的影响，并探讨其可能的机制，为肝癌的早期诊治提供新靶标。

1 材料与方法

1.1 主要材料 细胞：人肝癌细胞HepG2、MH97H及人正常肝细胞L-7702均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。主要试剂：DMEM、Opti-MEM及FBS购自美国Gibco公司；转染试剂Lipofectamine2000购自苏州宇恒生物科技有限公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；反转录及荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；引物合成自苏州金唯智生物科技有限公司；SCARNA10小干扰RNA(siRNA)及阴性对照RNA(NC)均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。抗体SUZ12(ab12073)、EZH2(ab3748)均购自英国Abcam公司；抗体IgG(PP64B)购自美国Millipore公司。

1.2 肝癌细胞与正常肝细胞中SCARNA10表达检测 采用实时荧光定量PCR(qPCR)法。将HepG2、MH97H及L-7702细胞接种于含10% FBS的DMEM培养基中，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。取对数生长期细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA；分光光度计检测RNA浓度及纯度，光密度(OD260/280)1.8～2.1为合格的RNA样本。取1 μg总RNA逆转录为cDNA，进行qPCR检测。引物序列：SCARNA10上游引物为5′-GTTTGGCTAAGCCCAGGGAC-3′，下游引物为5′-GTTGGTCTGCCCTTACAGTGA-3′；β-actin上游引物为5′-GCCGGGACCTGACTGACTAC-3′，下游引物为5′-TTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算SCARNA10相对表达量。

1.3 SCARNA10对肝癌细胞增殖影响的观察

1.3.1 细胞转染 转染前1 d将HepG2、MH97H细胞置于6孔板中培养，第2天细胞融合度达60%左右时进行转染。用Opti-MEM分别孵育siRNA、NC及Lipofectamine2000，并静置5 min。将Lipofectamine2000与Opti-MEM混合液分别加入siRNA与NC中，混匀后静置20 min。之后分别加入到HepG2、MH97H细胞中，转染36 h收集细胞。采用qPCR法检测细胞中的SCARNA10，方法同1.2；结果显示，转染siRNA的肝癌细胞中SCARNA10表达低于转染NC的细胞(P均<0.05)，提示转染成功。

1.3.2 细胞增殖能力观察 ①qPCR法：收集转染后的肝癌细胞，提取RNA；逆转录后，进行qPCR检测增殖细胞核抗原(PCNA)。PCNA上游引物为5′-TCCATCCTCAAGAAGGTGTT-3′，下游引物为5′-GGTAGGTGTCGAAGCCC-3′；GAPDH上游引物为5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,下游引物为5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算PCNA mRNA相对表达量。②CCK-8法：收集转染后的肝癌细胞，以4×103/孔接种96孔板，并设置5个复孔；每孔完全培养基终体积为100 μL，置于细胞培养箱中培养6 h。每孔加入CCK-8试剂10 μL，置于培养箱中孵育4 h，使用酶标仪检测波长450 nm处的OD值，判断细胞增殖活性。③克隆形成实验：收集转染后的肝癌细胞，以1×103/孔接种6孔板，置于细胞培养箱中培养，每隔2 d换液1次。待细胞形成肉眼可见的克隆集落，弃去培养基，PBS缓慢冲洗3次。4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min；PBS清洗后干燥，肉眼观察计数克隆形成数。上述实验均重复3次，取均值。

1.4 SCARNA10在肝癌细胞中的核质分布观察 采用核质分离提取实验。将HepG2和MH97H细胞分别接种于直径10 cm培养皿中，待细胞融合度达90%左右时收集细胞，使用PARIS试剂盒对核质组分分离提取。首先PBS缓慢冲洗细胞后，进行胰酶消化，将细胞转移至1.5 mL EP管中；在4 ℃下以500 r/min离心5 min，弃上清。加入500 μL Fractination Buffer，轻轻吹打后于冰上静置5 min。在4 ℃下以500 r/min离心5 min，将上清转移至新的无RNase的1.5 mL EP管中，此即为胞质；沉淀即为胞核。分别对细胞质和细胞核进行RNA提取及逆转录，参照方法1.2。以研究明确细胞核中分布较高的lncRNA MALAT1为阳性对照，其上游引物为5′-GCTCTGTGGTGTGGGATTGA-3′、下游引物为5′-GTGGCAAAATGGCGGACTTT-3′。采用qPCR法检测SCARNA10、MALAT1及β-actin(阴性对照)在细胞核和细胞质中的Ct值，计算相对表达比例。细胞核相对表达比例=2细胞核Ct-细胞质Ct/(1+2细胞核Ct-细胞质Ct)×100%，细胞质相对表达比例=1-细胞核相对表达比例。实验重复3次，取均值。

1.5 SCARNA10与SUZ12、EZH2的相互作用观察 采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验。用含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIP液分别裂解肝癌细胞，将细胞裂解产物与抗体偶联磁珠或对照IgG于4 ℃孵育6 h；将磁珠洗净并与蛋白酶K于冰上孵育5 min，4 ℃下以12 000 r/min离心10 min；进一步将磁珠分别与5 mg SUZ12或EZH2抗体混合，室温下360°旋转孵育30 min；取上清液，加入RIP缓冲液，4 ℃过夜。将产物进行荧光定量PCR检测，以IgG作为阴性对照，分析SCARNA10与SUZ12及EZH2的相对结合量。

2 结果

2.1 肝癌细胞与正常肝细胞中SCARNA10表达比较 HepG2、MH97H中SCARNA10相对表达量分别为2.94±1.00、4.61±1.23，均高于L-7702细胞中的1.11±0.21(P均<0.05)。

2.2 SCARNA10对肝癌细胞增殖的影响 与转染NC比较，转染siRNA的HepG2、MH97H细胞中PCNA mRNA表达量、细胞增殖OD值均降低，细胞克隆数均减少(P均<0.05)。见表1。

2.3 SCARNA10在肝癌细胞中的核质分布情况 核质分离提取实验显示，SCARNA10在HepG2、MH97H细胞胞核内的表达比例高于胞质内表达比例(P均<0.05)。见表2。

表1 HepG2、MH97H细胞转染后PCNA mRNA表达、细胞增殖及细胞克隆数比较

表2 HepG2、MH97H细胞胞核和胞质中β-actin、MALAT1、SCARNA10的相对表达比例

2.4 SCARNA10与SUZ12、EZH2的相互作用结果 HepG2细胞中SCARNA10与SUZ12、EZH2的相对富集量分别为5.05±1.39、3.95±0.67，MH97H细胞中分别为6.71±2.60、4.47±1.75。

3 讨论

人类基因组中只有约2%的基因参与编码蛋白质，其余多数基因虽不参与编码蛋白质，但可参与基因组印记、染色质修饰、X染色体沉默、转录激活及干扰等[12,13]。lncRNA可通过调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移及血管形成等过程，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用[14]。目前我国肝癌确诊主要通过肝穿刺进行活检，该项目为有创检查，且假阴性率较高。尽管肿瘤标志物AFP已作为肝癌的筛查指标，但其敏感度较低，大部分患者确诊时已进展为肝癌晚期，预后较差[15]。因此，临床上亟需找到特异度和敏感度均较高的标志物，以提高肝癌早期诊断率，从而改善患者预后[3]。

已有研究表明，lncRNA可通过不同机制参与肝癌的发生发展，但lncRNA SCARNA10在肝癌中的研究尚未有报道[16,17]。本研究利用两种人肝癌细胞HepG2和MH97H为体外研究模型，探讨SCARNA10在肝癌中的生物学功能。研究结果显示，SCARNA10在肝癌细胞中的表达高于人正常肝细胞；敲低SCARNA10表达后，发现HepG2与MH97H细胞中PCNA mRNA表达量相对减少，提示干扰SCARNA10后促增殖相关标志基因表达减低。进一步行CCK-8实验及克隆形成实验，发现HepG2与MH97H细胞敲低SCARNA10表达后细胞增殖OD值及克隆数均降低，提示干扰SCARNA10后肝癌细胞增殖能力降低。以上结果表明，SCARNA10在肝癌细胞中高表达且可促进肝癌细胞的增殖，其可作为促癌因子参与肝癌的发生。

为进一步探究SCARNA10促进肝癌发生的机制，通过核质分离提取实验发现SCARNA10主要定位于肝癌细胞核中，表明其可能通过与染色质修饰酶结合从而表观激活或沉默靶基因以发挥促癌作用。已有研究报道，约20%的lncRNA可与多梳抑制复合物PRC2的组分结合。PRC2主要参与基因沉默，其核心组分包含EED、SUZ12、EZH1和EZH2，其中EZH1和EZH2具有组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)甲基转移酶的功能[18,19]。EZH1和EZH2作为催化亚基，与另两个组分EED和SUZ12一起变构活化PRC2，从而介导H3K27三甲基化(H3K27me3)的形成；H3K27me3是一类非常重要的组蛋白修饰，通过抑制基因表达，在胚胎发育和疾病发生方面发挥重要作用[20]。然而，PRC2如何募集靶基因序列尚不明确。本研究RIP结果显示，SCARNA10可以与PRC2组分SUZ12和EZH2结合。因此，我们认为SCARNA10可能通过与SUZ12和EZH2结合，从而释放PRC2对下游基因的募集，以调控靶基因的表达，进一步促进肝癌细胞的增殖。但具体下游调控的基因及机制尚不明确，需未来进一步深入研究。

综上所述，SCARNA10可能在细胞核中通过与SUZ12、EZH2结合促进肝癌细胞增殖，从而参与肝癌的发生发展。本研究初步探明了SCARNA10在肝癌中的功能及机制，为肝癌的诊疗提供了新靶标。