施萌婧，臧运华，刘永吉，姜传武，刘柱

1 山东中医药大学，济南250014；2青岛市海慈医疗集团

胶质母细胞瘤(GBM)为被WHO列为Ⅳ级星形细胞瘤，是最常见且具有浸润性的原发性脑瘤。尽管目前采用了最大限度地安全切除、放疗和化疗等治疗方法，但其易产生耐药性导致复发。耐药和复发均与细胞凋亡抑制有关，Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白，作为其切割底物PARP可间接反映Caspase-3活性。近年来研究发现，靶向治疗可能是GBM治疗的一种合理、实用的选择。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)可选择性诱导肿瘤细胞凋亡，是治疗GBM最有希望的靶向药物之一。然而，有证据表明GBM对TRAIL的单一治疗完全耐药[1]。淫羊藿苷(ICA)是淫羊藿属淫羊藿的水解产物，最近发现其可以诱导人子宫内膜癌细胞凋亡[2]；并且，研究发现ICA可以通过血脑屏障[3]，使其成为治疗GBM的理想候选药物。因此，这提示我们ICA有可能作为TRAIL诱导GBM细胞凋亡的致敏剂。2018年10月～2019年7月，我们观察了ICA对TRAIL诱导GBM细胞凋亡的影响，并探讨其分子机制，旨在鉴定ICA是否对TRAIL具有致敏作用，为GBM治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 主要材料 GBM细胞U87(中度耐药)和U373(重度耐药)购自中国科学院上海细胞库，胎牛血清(FBS)、DMEM培养基购自美国HyClone公司；DT5-3型低速自动平衡离心机(北京时代北利离心机有限公司)；CCK-8试剂盒(日本Wako公司)；流式细胞仪(美国BD公司)，Annexin V-FITC检测凋亡专用试剂盒(美国BD公司)，磷脂酰丝氨酸(PS，上海经科化学科技有限公司，JKLN001185a)，碘化丙啶(PI,美国Oncogene公司)；Caspase-3 (英国Bioss，Bs-0081R)；PARP单克隆抗体(亚克因生物技术有限公司，ABM0042)；辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG(北京博尔西公司，BHR208)，化学发光试剂(ECL，美国Amersham公司),Image J图像分析软件(美国NIH公司,BYS-SS161)；Caspase-3活性检测试剂盒(比色法，南京凯基生物技术公司)，ELX-800酶标仪(美国BIO-TEK公司,KYLS-216)；Caspase抑制剂z-VAD-fmk (美国Sigma公司)；pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS，武汉普诺赛生命科技有限公司，PB180327)。

1.2 细胞培养 将U87和U373细胞接种于含10% FBS的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养。

1.3 TRAIL、ICA作用浓度的确定 将GBM细胞以1×104/孔接种96孔板，加入100 μL培养基中过夜培养；细胞融合后，分别加入不同浓度的TRAIL(0、10、20、50、100、200 ng/mL)或ICA(0、2.5、5、10、20 μmol/L)处理48 h，使用CCK-8试剂盒通过MTT法测定细胞存活率。结果显示，100 ng/mL TRAIL或20 μmol/L ICA处理48 h后U87细胞存活率降低(P均<0.05)，而U373细胞在此剂量下存活率均未明显降低，故选择尚未导致统计学意义的上一浓度即50 ng/mL TRAIL、10 μmol/L ICA作为作用浓度。

1.4 细胞凋亡率测算 将U87和U373细胞各自分成4组：TRAIL组加50 ng/mL TRAIL，ICA组加10 μmol/L ICA，TRAIL+ICA组加50 ng/mL TRAIL+10 μmol/L ICA，对照组加等体积DMSO，处理48 h后采用流式细胞术检测凋亡细胞。使用Annexin V试剂盒，通过Annexin V-FITC检测PS的膜外作用来评估被测细胞的凋亡诱导；在处理后不同时间间隔采集2×105个细胞，用PBS洗涤2次，然后在200 μL的Binding Buffer中继续培养。加入Annexin V-FITC和1 μg/mL PI，并在黑暗环境下孵育15 min；加入300 μL的1×Binding Buffer停止反应，用流式细胞仪分析标记凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.5 细胞中Caspase-3、PARP蛋白检测 细胞分组与处理同1.4，采用Western blotting法检测Caspase-3、PARP蛋白。蛋白质经SDS-PAGE电泳分离，电泳转移到硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉在PBS-Tween-20(0.1%，V/V)中对硝化纤维素膜进行封闭，4 ℃过夜孵育。将该膜与初级抗体(根据制造商的说明书稀释)孵育2 h，辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG用作第二抗体。ECL显色，用Image J软件测量谱带的光密度。以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.6 细胞裂解物中Caspase-3活性检测 细胞分组与处理同1.4，采用比色测定法测量细胞裂解物中的Caspase-3活性。将1×106个细胞用PBS充分洗涤，重悬于50 μL裂解缓冲液中，在冰浴中孵育60 min。将溶液以10 000 g离心1 min，收集上清液；在37 ℃下与酶特异性比色底物孵育4 h，用ELISA酶标仪在405 nm波长下测定比色产物。

1.7 Caspase在ICA对TRAIL诱导GBM细胞凋亡中的作用观察 将两种细胞随机分为4组：阻断组和阻断处理组先予以Caspase抑制剂z-VAD-fmk(25 μmol/L)预处理4 h后再分别加DMSO、TRAIL+ICA，对照组和处理组不预处理分别加DMSO、TRAIL+ICA，ICA、TRAIL作用浓度分别为10 μmol/L、50 ng/mL。处理48 h后采用流式细胞术测算细胞凋亡率，方法同1.4。

2 结果

2.1 ICA对TRAIL诱导GBM细胞凋亡的影响 TRAIL+ICA组细胞凋亡率高于对照组、ICA组、TRAIL组(P均<0.05)，对照组、ICA组、TRAIL组两两比较差异均无统计学意义。见表1。

表1 ICA对RAIL诱导GBM细胞凋亡的影响

2.2 ICA对TRAIL诱导GBM细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达的影响 TRAIL+ICA组细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达量高于对照组、ICA组、TRAIL组(P均<0.05)，对照组、ICA组、TRAIL组两两比较差异均无统计学意义。见表2。

表2 ICA对TRAIL诱导GBM细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达的影响

2.3 ICA对TRAIL诱导GBM细胞裂解物中Caspase-3活性的影响 TRAIL+ICA组细胞裂解物中Caspase-3活性高于对照组、ICA组、TRAIL组(P均<0.05)，对照组、ICA组、TRAIL组两两比较差异均无统计学意义。见表3。

表3 ICA对TRAIL诱导GBM细胞裂解物中Caspase-3活性的影响

2.4 Caspase在ICA对TRAIL诱导GBM细胞凋亡中的作用 处理组细胞凋亡率高于对照组、阻断组、阻断处理组(P均<0.05)，对照组、阻断组、阻断处理组两两比较差异均无统计学意义。见表4。

表4 Caspase在ICA对TRAIL诱导GBM细胞凋亡中的作用

3 讨论

GBM是一种主要发生于成年人的原发性脑肿瘤，具有高致死率和侵袭性的特点，患者中位生存期约为14.6个月。研究发现，GBM的异质性是其治疗难度高于其他肿瘤的原因之一[4]。动物体内研究发现，人类TRAIL可以抑制异种移植小鼠体内GBM的生长，具有作为抗肿瘤药物的潜力[5]。

细胞死亡为细胞膜完整性的不可逆丧失，根据形态学标准可分为凋亡、自噬和坏死3种类型[6]。细胞凋亡是由细胞内死亡程序激活而引发的程序性细胞死亡。越来越多的证据表明，诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的癌症治疗策略。然而，GBM细胞对凋亡刺激表现出极强的抵抗性[7]。此外，有研究表明，GBM干细胞(GSCs)具有极强的抗化疗和抗辐射能力，并能促进肿瘤的生长和发展，加剧了GBM的抗凋亡性[8,9]。本研究也发现，100 ng/mL TRAIL处理48 h后U87细胞存活率降低，而U373细胞在200 ng/mL剂量下存活率未明显降低；这与先前的研究一致，即U87细胞对TRAIL是中度耐药，而U373细胞是显著耐药的[10]。因此，开发新的治疗方案，克服分化的肿瘤细胞和GSCs对凋亡刺激的抵抗，是保证肿瘤彻底根除的必要条件。然而，已知大多数GBM细胞对TRAIL存在抵抗[11]，这在很大程度上限制了TRAIL的临床应用。

近10年来，许多研究都强调了TRAIL与另一种抗肿瘤药物联合治疗以克服GBM对TRAIL耐药性的可行性。临床前研究表明，TRAIL和替莫唑胺可延长GBM异种移植小鼠的生存期[12]。TRAIL在与肿瘤细胞上的死亡受体TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)结合后[13]，募集死亡受体结构域链接蛋白(FADD)到受体上，再通过FADD中的死亡效应结构域(DED)募集起始Caspase(pro-Caspase-8/10)到受体复合物上，形成死亡诱导信号复合体(DISC)。pro-Caspase-8/10在DISC中自我活化，形成活性Caspase-8/10并释放到细胞质中，激活下游Caspase信号级联诱导细胞凋亡[10,14]。而Caspase-3处于细胞凋亡的级联反应途径中的核心位置，凋亡信号传导通路中的关键环节就是激活Caspase-3并促进其表达。在脑缺血/再灌注损伤中，Caspase-3在神经细胞损伤的病理过程中发挥着重要作用。Le等[15]研究发现，与对照组相比，Caspase-3基因缺乏的缺血/再灌注大鼠模型，皮层梗死的体积减少55%，凋亡细胞数减少36%。这说明Caspase-3参与了神经细胞凋亡的病理过程，抑制了Caspase-3的表达，并且能减轻神经损伤及神经细胞的凋亡。PARP是Caspase-3的切割底物，也是Caspase-3激活的标志。Caspase-3被激活后构象发生改变形成剪切体Cleaved Caspase-3,Cleaved Caspase-3进一步剪切PARP，使总PARP减少、Cleaved PARP增加，导致PARP失去正常功能，最终使得核小体间DNA降解、细胞发生凋亡[16]。

近期，有报道称一些天然化合物能使GBM细胞在体外对化疗产生敏感性[17]。淫羊藿是传统中药，具有温补肾阳、祛风除湿的功效，在临床中应用广泛。经查阅文献，我们发现ICA具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并可以通过血脑屏障，使其成为TRAIL增敏作用的理想候选药物。本研究结果显示，与对照组、ICA组、TRAIL组比较，TRAIL+ICA组细胞凋亡率增高，细胞中Caspase-3、PARP蛋白表达量增加，细胞裂解物中Caspase-3活性增强；对照组、ICA组、TRAIL组两两比较，差异均无统计学意义；处理组细胞凋亡率高于对照组、阻断组、阻断处理组，对照组、阻断组、阻断处理组两两比较差异均无统计学意义。以上结果表明，ICA通过Caspase依赖性方式促进TRAIL诱导的GBM细胞凋亡。我们认为，ICA与TRAIL合用是一种有效的凋亡复合物，可为GBM的治疗提供有效策略。但是，由于体内细胞凋亡过程十分复杂，尚需进一步进行动物实验以验证其有效性。