房昉 温伟波 杨龄 谢雪华 陶丽玲

摘要：目的 初步建立健肝消脂方医院制剂的质量标准。方法 采用薄层色谱法分别定性鉴别该医院制剂中的三七、赤芍、青皮、黄芪，采用高效液相色谱法定量测定该医院制剂中丹酚酸B的含量。结果 在选定的薄层色谱条件下，供试品色谱与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，分离效果较好，专属性强。高效液相色谱法测定丹酚酸B的线性范围在0.101 μg～2.525 μg之间，线性关系良好（r2=1）。平均回收率为101.7%，相对标准偏差值为0.98%。结论 该方法简便可行、专属性强、重现性好，可作为初步质量标准用于控制该制剂的质量。

关键词：健肝消脂方;薄层色谱法;高效液相色谱法;质量标准

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）09-0073-06

Preliminary Study on Quality Standard of Hospital Preparationsof Jiangan Xiaozhi Prescription

FANG Fang1，WEN Wei-bo1，YANG Ling2，XIE Xue-hua1，TAO Li-ling2

（1. The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650021，China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

【Abstract】Objective： To preliminarily establish the quality standard of hospital preparation of Jiangan Xiaozhi prescription. Methods： TLC was used to qualitatively identify Panax notoginseng，Radix paeoniae rubra，Pericarpium Citri，and Astragalus membranaceus in the hospital preparation，and the content of salvianolic acid B in the hospital preparation was quantitatively determined by HPLC. Results： Under the selected TLC conditions，spots of the same color appeared on the corresponding positions of the chromatogram of the test substance and the chromatogram of the reference substance，with good separation effect and strong specificity. The linear range of salvianolic acid B measured by HPLC was between 0.101 μg～2.525 μg，and the linear relationship is good （r2=1）. The average recovery rate was 101.7%，and the relative standard deviation value was 0.98%. Conclusion： The method is simple and feasible，with strong specificity and good reproducibility，and can be used as a preliminary quality standard to control the quality of the preparation.

【Key words】Jiangan Xiaozhi prescription，TLC，HPLC，quality standard

健肝消脂方是由云南中醫药大学第一附属医院温伟波主任医师根据其多年诊治非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的临床经验所拟定。目前该方已在临床上得到了广泛应用，临床疗效优良。该方由丹参、三七、赤芍、青皮、黄芪等十二味中药组成，具有活血化痰、健肝消脂的功效。但其汤剂剂型临床服用不便，为便于患者服用，我们以颗粒剂的形式制备了健肝消脂方医院制剂，并采用薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）对方中三七、赤芍、青皮、黄芪进行定性鉴别，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对丹参中丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）的含量进行定量测定，以期为有效地控制健肝消脂方医院制剂的质量提供方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2030高效液相色谱仪（日本岛津公司），CPA225D分析天平（德国赛多利斯公司），KQ-500B超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂试药 三七（批号：20180701）、赤芍（批号：20180901）、青皮（批号：20180701）、黄芪（批号：20180902）饮片（均购自昆明道地中药饮片厂，符合2015年版《中国药典》标准）。丹酚酸B（批号：111562-201716）、人参皂苷Rb1（批号：110704-201827）、人参皂苷Rg1（批号：110703-201832）、三七皂苷R1（批号：110745-201820）、芍药苷（批号：110736-201943）、橙皮苷（批号：110721-201818）、黄芪甲苷（批号：110781-201717）（均购自中国食品药品检定研究院）;薄层层析用硅胶G（青岛海洋化工有限公司）;甲醇[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号：178507]、乙腈（Sigma-Aldrich Co，LLC，批号：WXBC9206V）均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 三七TLC鉴别 根据《国家中成药标准汇编》所载三七脂肝丸的国家药品标准[WS-10285（ZD-0285）-2002]及《中华人民共和国药典》相关内容[1]进行操作。

2.1.1 供试品溶液制备 取健肝消脂方医院制剂10 g，研细，加乙醚50 mL，浸渍1 h，超声处理5 min，滤过，弃去乙醚液，药渣挥干乙醚，加水饱和的正丁醇25 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液置分液漏斗中，用正丁醇饱和的氨试液洗2次，每次20 mL，放置分层，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2 阴性样品溶液制备 按处方取除去三七以外的药材，按照制备方法制成挥发油包合物及提取浸膏，按照制备处方比例混合辅料，称取适量，按照2.1.1制备方法制成阴性样品溶液。

2.1.3 对照品溶液制备 取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品，分别加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.1.4 鉴别方法 吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15：40：22：10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液（1→10），在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品溶液无干扰，见图1。

2.2 赤芍TLC鉴别[1]

2.2.1 阴性样本溶液制备 按处方取除去赤芍以外的药材，按照制备方法制成挥发油包合物及提取浸膏，按照制备处方比例混合三七粉、辅料，称取适量，按照2.1.1方法制成阴性样品溶液。

2.2.2 对照品溶液制备 取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 鉴别方法 吸取2.1.1项下的供试品溶液、2.2.1项下阴性样品溶液和2.2.2项下对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性溶液无干扰，见图2。

2.3 青皮TLC鉴别[1]

2.3.1 供试品溶液制备 取健肝消脂方医院制剂10 g，研细，加水40 mL浸泡15 min，时时振摇，滤过，滤液加乙醚振摇洗涤3次，每次30 mL，水层加乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，浓缩至2 mL，作为供试品溶液。

2.3.2 阴性样品溶液制备 按处方取除去青皮以外的药材，按照制备方法制成挥发油包合物及提取浸膏，按照制备处方比例混合三七粉、辅料，称取适量，按照2.3.1制备方法制成阴性样品溶液。

2.3.3 对照品溶液制备 取橙皮苷对照品，加乙酸乙酯制成1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3.4 鉴别方法 吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（32：17：5）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷于1%三氯化铝乙醇溶液，置紫外灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性溶液无干扰，见图3。

2.4 黄芪TLC鉴别[2-3]

2.4.1 供试品溶液制备 取健肝消脂方医院制剂5 g，研细，加2%氢氧化钾甲醇溶液50 mL，加热回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，用三氯甲烷-正丁醇（2：1）溶液振摇提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷-正丁醇溶液，加1%磷酸二氢钾溶液洗涤2次，每次25 mL，三氯甲烷-正丁醇溶液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.4.2 阴性样品溶液制备 按处方取除去黄芪以外的药材，按照制备方法制成挥发油包合物及提取浸膏，按照制备处方比例混合三七粉、辅料，称取适量，按照2.4.1制备方法制成阴性样品溶液。

2.4.3 对照品溶液制备取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.4.4 鉴别方法 吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13：7：2）10℃下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性溶液无干扰，见图4。

3 定量分析

依据健肝消脂方医院制剂制备方法，丹参采用水提方式，故选择丹参药材中水溶性有效成分丹酚酸B为含量测定指标，检测方法为HPLC[1]。

3.1 色谱条件 色谱柱：ACE-EXL-121-2546U（C18，250×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（24：76）;检测波长：286nm;流速：1.2 mL/min。此条件下丹酚酸B与其他组分达到有效分离（r>1.5），理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于6000。

3.2 溶液制备

3.2.1 供试品溶液的制备 取健肝消脂方医院制剂适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.2.2 阴性样品溶液的制备 按处方比例，称取除丹参以外其他药材，按照制备方法制成阴性样品，称取适量，再按照3.2.1的制备方法，制得。

3.2.3 对照品溶液的制备 取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

3.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、5、10、20、25 μL进行色谱测定，测定峰面积。以进样量为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并以进样量对峰面积进行回归，得回归方程为Y=1125797X-2657，r2=1，表明进样量在0.101 μg-2.525 μg范围内呈良好的线性关系。

3.4 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图，供试品溶液色谱图与对照品色谱图丹酚酸B有相同保留时间色谱峰，阴性样品溶液色谱图丹酚酸B相应位置未见有峰，方中其他药材、辅料均对丹酚酸B含量测定不产生干扰，方法专属性良好，方法可行。见图5至图7。

3.5 稳定性考察 取健肝消脂方医院制剂适量参照3.2.1制备方法制成供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、18、24 h精密吸取注入液相色谱仪，记录色谱图，峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为0.30%，稳定性良好。

3.6 重复性考察 取健肝消脂方医院制剂6份，参照3.2.1制备方法制成供试品溶液，测定含量，结果示供试品平均含量为1.69 mg/g，RSD值为1.96%，重复性良好。

3.7 准确度考察 采用加样回收法测定。取6份已知含量供试品（含量0.12%）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入丹酚酸B对照品溶液（浓度1.001 mg/mL）0.8、1.2、2.0 mL，加50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率500W，频率40kHz）30 min，放冷，加50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液测定，结果见表1。

3.8 供试品溶液制备方法考察

3.8.1 提取溶剂考察 取健肝消脂方医院制剂约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇各50 mL，称定重量，超声处理（功率500W，频率40kHz）30 min，放冷，分别加甲醇、80%甲醇、50%甲醇、乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定，结果见表2。

表2试验结果表明：50%甲醇有效成分提取效率最高，故将供试品溶液制备所用溶剂定为50%甲醇。

3.8.2 提取时间考察 取健肝消脂方医院制剂约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，分别超声处理（功率500W，频率40kHz）60、90 min，放冷，分别加50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定，结果见表3。

试验结果表明：50%甲醇为溶剂，采用超声处理方法，30 min与60 min相近，90 min含量有所降低，可能由于超声时间过长而溶液温度上升有关，故提取时间定为30 min。

3.9 样品测定 对3批样品进行含量测定，测定结果见表4。

4 讨论

由于本品成分较多，供试品处理较为关键。在制剂的定性分析中，曾对三七供试品溶液制备方法进行研究。供试品未经乙醚处理所制备的供试品溶液，经试验展开后，在与对照品相应的位置上主斑点显色不清晰;而经乙醚处理后，试验效果良好。除此之外，我们曾对青皮供试品溶液制备方法进行研究，按照《中华人民共和国药典》青皮药材制备方法制备，供试品在与对照品相应的位置上主斑点显色不清晰，经乙醚除杂处理后，试验效果良好。

三七、丹参均是健肝消脂方中的君药。三七味甘、微苦，性温，归肝、胃、心、大肠经，具有散瘀之功，传统中医学用于治疗脘胁久痛，癥瘕积块等病症;现代研究证实，三七能够提高肝组织中超氧化物歧化酶的活性，还可降低血糖，临床可用于治疗高脂血症、丙氨酸氨基转移酶增高症[4]。而中外多部药典均把人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1作为三七含量测定的重要标准[5]。丹参味苦、微寒，归心、心包、肝经，具有活血祛瘀之功，传统中医学于治疗癥瘕积聚等病证;现代研究证实，丹参具有调节血脂、保护肝损伤、促进肝细胞再生、抗肝纤维化等作用，可用于改善高脂血症，可用于治疗高脂血症、糖尿病、肝纤维化等疾病[4]。而丹酚酸B是丹参中的重要水溶性酚酸类化合物，是丹参的主要有效成分之一，也是丹参质量控制的重要指标之一[6-8]。

而赤芍、青皮、黄芪则均为健肝消脂方中的臣药。赤芍味苦，性微寒，归肝、脾经，具有活血祛瘀之功，现代药理学研究证实赤芍具有保肝作用，而芍药苷则是赤芍TLC鉴别的主要对照品，同时芍药苷也是赤芍的主要品质标志物[4]。青皮味苦、辛，性温，归肝、胆、胃经，具有消积化滞之功，现代药理证实青皮具有保护肝细胞的功能，而橙皮苷则是青皮TLC鉴别的主要对照品，同时橙皮苷也是青皮的主要品质标志物[4]。黄芪味甘，性温，归肺、脾经，具有益气升阳之功，现代药理研究证实黄芪具有良好的清除自由基、抗氧化作用，对于NAFLD模型大鼠，黄芪水煎剂能有效调节其血脂水平、保护肝功能和降低脂质过氧化水平，而黄芪甲苷则是黄芪TLC鉴别的主要对照品之一，同时黄芪甲苷也是黄芪的主要品质标志物之一[4-9]。

中药复方制剂的质量控制是目前中医药现代化发展过程中的一个难点，而基于质量标志物（Q-marker）的中药复方制剂评价方法已经受到了广大学者的重视[10-11]。我们的研究中，以丹酚酸B、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、芍药苷、橙皮苷、黄芪甲苷作为健肝消脂方的质量标志物，采用经典方法对上述指标进行检测，初步确立了健肝消脂方医院制剂的质量标准。但今后仍应立足于中药复方制剂的已知有效成分及中药复方的临床功效，利用先进技术，进一步深入研究该制剂的质量评价方法。

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（收稿日期：2020-05-07）