王丽丽，战帅帅，谢 磊，王继庆，哈尼开·马坎，任 毅，时 佳，耿洪伟

(新疆农业大学农学院/新疆农业大学生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】小麦是最重要的粮食作物之一[1-3]。品质已成为我国小麦主要育种目标，同时影响我国小麦产业竞争力[4]。面粉和面制品的颜色对小麦磨粉品质有重要影响[5]。面粉中蛋白质含量、氧化酶类活性以及色素类物质的积累对面粉及其制品的颜色有显著影响[6-8]。过氧化物酶(POD, Peroxidase)是由多基因家族基因编码的蛋白[2]，广泛存在于所有生物体中，能氧化各种氢供体，如酚类物质、胺、抗坏血酸、吲哚和某些无机离子[9]。小麦籽粒中的POD活性对面粉色泽具有褐变和漂白的双重作用，是影响面包、馒头、面条白度的重要因素，POD活性高的小麦品种(系)面粉白度更高[10]。小麦籽粒过氧化物酶(POD，Peroxidase)活性对小麦加工品质和面粉色泽具有重要影响。研究小麦籽粒POD，对小麦面粉颜色及加工品质的改良具有重要意义。【前人研究进展】POD活性受遗传因子、生态环境和栽培措施等影响，但主要受遗传控制[11,12]。在禾本科作物中，普通小麦POD活性是燕麦、水稻和玉米的3～7倍[13]，且显著高于(P<0.05)硬粒小麦[14-15]。在普通小麦的不同品种(系)间POD活性也可相差3～10倍[16-17]。通过遗传途径培育高POD活性品种(系)是可行的[18]。Rebordinos等[19]利用同源线性定位研究表明，普通小麦POD活性基因位于第3和第7同源染色体组上，尤其是第3同源染色体。Brenchley等[20]研究表明，POD基因类型多，分布广，在A，B，D组中都有分布，Sareini等(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF525425)克隆了普通小麦籽粒中的Class Ⅲ型POD活性基因(WP1)的全长序列(AF525425)。魏景欣[3]选用豆麦/石 4185 RIL 群体结合90K的iSelect基因芯片进行POD活性基因定位，发现QPod.caas-3AL、QPod.caas-4BS和QPod.caas-5AS3个主效位点，基于效应值大的QPod.caas-3AL位点进行同源克隆，克隆了3A染色体POD基因TaPod-A1基因组DNA(gDNA)全长编码序列并且开发了一对显性互补功能标记POD-3A1/POD-3A2。时佳等[18]选用黄淮麦区材料151份与北部冬麦区82份品种(系)结合90K iSelect芯片对小麦品种(系)籽粒POD活性基因进行GWAS，发现2A、2D、5A、6A、7B和7D等多个稳定遗传的位点，基于效应值大的7D位点进行同源克隆，克隆了7D染色体TaPod-D1基因gDNA全长编码序列并且开发了一对显性互补功能标记利用POD-7D1/POD-7D6。耿洪伟等[8]利用TaPod-A1位点功能标记POD-3A1/POD-3A2对129份新疆小麦品种(系)标记检测发现，新疆小麦品种(系)以含有低POD活性相关的TaPod-A1a(的等位变异类型为主。谢磊等[21]利用TaPod-D1位点的功能标记POD-7D1/POD-7D6对98份新疆冬小麦品种(系)进行分子检测显示，新疆冬小麦品种(系)以含有低POD活性相关的TaPod-A1a的等位变异类型为主。【本研究切入点】虽然前人已有对新疆小麦POD活性相关基因等位变异分布情况的报道，但尚未有新疆小麦POD活性及新疆春小麦TaPod-D1基因的等位变异分布情况的报道。研究新疆小麦品种(系)过氧化物酶活性高低并分析相关基因变异类型和分布。【拟解决的关键问题】对113份新疆小麦品种(系)进行POD活性检测，结合POD-3A1/POD-3A2和POD-7D1/POD-7D6分子标记结果，研究新疆小麦品种(系)TaPod-A1和TaPod-D1基因的等位变异分布频率及其与POD活性之间的关系，验证分子标记POD-3A1/POD-3A2和POD-7D1/POD-7D6的有效性，为利用分子标记选择高POD活性小麦品种(系)和改良新疆小麦面粉品质奠定理论和材料基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

选用113份新疆小麦品种(系)为供试材料，其中89份新疆冬小麦品种(系)和24份新疆春小麦品种(系)；冬小麦品种(系)包括16份地方品种(系)、34份引进品种(系)和39份自育品种(系)，春小麦品种(系)包括4份早期品种(系)(2000年前审定)和20份近期品种(系)(2000年后审定)。所有冬小麦材料均于2016～2017和2017～2018年2个年度播种于新疆农科院玛纳斯试验站，随机区组设计，2 m行长，每行120粒，行距20 cm，每个品种(系)种植3行，2次重复。田间管理与当地大田生产一致，成熟收获后，人工脱粒。

1.2 方 法

1.2.1 POD活性检测

称取15 g去杂去劣的小麦籽粒采用配备0.8 mm筛子的旋风磨(瑞典LaboratoryMill 120)研磨成全麦粉放置于4℃待测。采用魏景欣等[3]方法，测定POD活性，2次重复，若2次检测的结果相差超过10%，需重复检测。单位POD活性(U)被定义为每克全麦粉每分钟反应产物在470 nm处的吸光度增加0.01。

1.2.2 POD活性分子标记检测

耿洪伟等[8]已对新疆冬小麦品种(系)进行TaPod-A1和TaPod-D1位点的等位变异检测，谢磊等[21]也对新疆春小麦品种(系)进行了TaPod-D1位点的等位变异检测，研究采用耿洪伟等[22]的方法，取3粒有代表性的种子提取基因组DNA，随后利用时佳等[18]开发的功能标记POD-7D1/POD-7D6检测24份新疆春小麦品种(系)，根据每个小麦品种(系)DNA标记结果判断其基因型。表1

表1 用于检测POD活性基因的分子标记及其引物序列

1.3 数据处理

用Excel进行数据统计和相关性分析，采用IBM SPSS statistics 21对数据进行t检验及单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同类型小麦的POD活性

研究表明，新疆小麦品种(系)的POD活性分布范围很广(730～4 600 U/(g·min))，最高、最低POD活性相差6倍，其POD平均活性为2 436.5 U/(g·min)，不同年份间POD活性相关系数为0.6(P<0.01)。新疆春小麦的POD活性(2 507.8 U/(g·min))高于新疆冬小麦的POD平均活性(2 417.2 U/(g·min))。在新疆冬小麦中，POD活性表现为引进品种(系)(活性为2 501.7 U/(g·min))>地方品种(系)(2 473.9 U/(g·min))>自育品种(系)(2 320.3 U/(g·min))；在新疆春小麦中，POD活性表现为近期品种(系)(2 524.0 U/(g·min))>早期品种(系)(2 426.9 U/(g·min))。表2

表2 不同类型新疆小麦品种(系)的POD活性

2.2 2个基因位点不同等位变异的POD活性

研究表明，在TaPod-A1位点，具有TaPod-A1b等位变异类型品种(系)的POD活性(2 595.3 U/(g·min))极显著(P<0.01)高于具有TaPod-A1a等位变异类型品种(系)(2 346.0 U/(g·min))，TaPod-A1b为优异等位变异，在新疆冬小麦麦引进品种(系)和新疆春小麦早期品种(系)中2个等位变异类型的材料间POD活性均具有极显著差异(P<0.01)；在TaPod-D1位点，具有TaPod-D1b等位变异类型品种(系)的POD活性(2 503.9 U/(g·min))显著(P<0.05)高于具有TaPod-D1a等位变异类型品种(系)(2 376.9 U/(g·min))，在新疆冬小麦品种(系)中2个等位变异类型的材料间POD活性具有显著差异(P<0.05)。TaPod-A1位点检测与魏景欣[3]一致，可用于新疆小麦POD活性的辅助选择，而TaPod-D1位点的检测结果显示TaPod-D1b为优异等位变异。表3

表3 不同类型小麦材料不同等位变异的POD活性

2.3 TaPod-A1和TaPod-D1位点等位变异组合与POD活性的关系

在检测的113份新疆小麦材料中，TaPod-A1和TaPod-D1基因位点共存在TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1a/TaPod-D1b、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b四种等位变异组合类型。不同组合类型的总体分布比例表现不同。研究表明，2个高POD活性等位变异组合TaPod-A1b/TaPod-D1b(活性为2 706.2 U/(g·min))显著高于由2个低POD活性的等位变异组合TaPod-A1a/TaPod-D1a(2 283.6 U/(g·min))，由一个高POD活性和一个低POD活性等位变异组合的TaPod-A1a/TaPod-D1b(2 408.4 U/(g·min))和TaPod-A1b/TaPod-D1a(2 516.8 U/(g·min))POD活性无显著差异。将2个功能标记组合使用，可以提高优异等位基因的选择效率。表4

表4 2个基因不同等位变异的POD活性

2.4 不同类型春小麦品种(系)中 TaPod-A1 和 TaPod-D1位点等位变异的分布频率

研究表明，在TaPod-A1位点，新疆春小麦品种(系)中具有TaPod-A1b变异类型的材料有17份(占70.8%)，为优势等位变异，其中早期品种(系)和近期品种(系)TaPod-A1b分布频率分别为75.0%和70.0%，在TaPod-D1位点，具有TaPod-D1a在新疆春小麦品种(系)资源中有20份(83.3%)，为优势等位变异，其中早期品种(系)和近期品种(系)TaPod-D1a分布频率分别为100.0%和80.0%，无论是从新疆春小麦品种(系)的总体还是从早期或近期来看，均表现出TaPod-A1b和TaPod-D1a为优势等位变异。在24份新疆春小麦材料中共有TaPod-A1a/TaPod-D1a、TaPod-A1b/TaPod-D1a和TaPod-A1b/TaPod-D1b3种等位变异，TaPod-A1b/TaPod-D1a在24份新疆小麦品种(系)、早期品种(系)或近期品种(系)分布频率分别为54.2%、75.0%和50.0%，均表现为优势等位变异。表5

表5 不同类型新疆春小麦材料不同等位变异的频率

3 讨 论

3.1 POD活性的测定

研究表明，新疆推广种植的小麦品种(系)POD活性高，品种(系)间活性变异范围大，其POD活性总体要高于全国3个主产麦区(北部冬麦区、黄淮麦区和长江流域与西南麦区)推广的品种(系)[3]。从不同生产麦区来看，新疆小麦籽粒POD活性最低略高于中国北部冬麦区小麦品种(系)(729.36 U/(g·min))的活性，最高是长江流域与西南麦区的小麦品种(系)(653.38 U/(g·min))的7倍。主要是由气候条件的差异造成的，新疆的干旱半干旱地区，年降雨量平均为117.8 mm，是我国典型的干旱少雨地区，还有诸如盐渍化和高温等非生物逆境胁迫，更易引起品种(系)的POD活性增高[23-26]。相比于其他麦区，新疆小麦品种(系)与中国北部冬麦区的小麦品种(系)籽粒POD活性最为接近，这主要是由于北部冬麦区与新疆纬度相近，寒、旱等自然条件也更为相近[27-28]。从新疆不同类型小麦的POD活性来看，新疆春小麦POD平均活性(2 507.8 U/(g·min))高于新疆冬小麦的POD平均活性(2 417.2 U/(g·min))。相吉山等[29]和桑伟等[30]通过对新疆小麦品种(系)资源籽粒性状和磨粉品质的研究，发现新疆春小麦品种(系)的蛋白质含量往往比冬小麦高，作为籽粒蛋白质组成部分的POD含量也相应提高[31]，从而导致春小麦POD活性的偏高[32]，因此，新疆春小麦品种(系)有助于高POD活性品种(系)的遗传改良。在新疆冬小麦品种(系)中，引进品种(系)POD活性显著高于自育品种(系)和地方品种(系)，因此,引进品种(系)是新疆小麦面粉品质遗传改良的重要途径，在新疆小麦育种工作中应通过积极引进外地品种(系)，来改善新疆小麦的面粉品质。在新疆春小麦中，近期品种(系)POD活性高于早期品种(系)，除了消费者对小麦品质越来越高的关注和需求之外[33]，也源于新疆小麦育种近年来比较注重对面粉色泽的选择[34-35]，使有利于提高小麦面粉白度的高POD活性基因得以在近期品种(系)中被保留。

3.2 POD活性相关基因TaPod-A1和TaPod-D1分子检测结果

新疆小麦品种(系)在TaPod-A1和TaPod-D1 2基因位点，均以含有低POD活性相关的TaPod-A1a(63.7%)和TaPod-D1a(53.1%)的等位变异类型为主，这2种等位变异类型在均高于新疆小麦品种(系)中的分布频率高于全国冬小麦品种(系)。而与高POD活性相关的优异等位变异组合TaPod-A1b/TaPod-D1b在新疆冬、春小麦品种(系)中分布频率均较低，分别只有14.6%和15.0%。赵广才等[36]研究表明，我国小麦品质研究起步较晚，前期更多的关注于产量性状，忽视了品质的遗传改良，而品质与产量存在一定负相关[37]，在进行高产选择的同时，不经意间使非优异等位变异类型在选育过程中得到了积累。优异等位变异组合TaPod-A1b/TaPod-D1b在新疆冬小麦材料分布频率大小为引进品种(系)>自育品种(系)>地方品种(系)，而在新疆春小麦材料中的分布频率为近期品种(系)>早期品种(系)。表明新疆地方品种(系)对新疆小麦的早期育种工作有较大影响，外来种质的引入使得小麦优异等位变异频率得到提升；与此同时，近期品种和自育品种多为以地方品种或自育品种(系)和外引品种为亲本所育，外来种质的引入有力地推进了小麦品质的遗传改良。因此，在今后育种工作中，应积极引进国内外优质品质(系)，采用优异等位变异类型品种(系)为亲本，对于提高新疆小麦品种(系)优异等位变异的频率，进而加快新疆小麦品质的遗传改良是可行的。

3.3 POD活性相关分子标记的实用性

功能标记以其准确、高效、简单的特点而大规模应用于作物育种[38]，功能标记的开发及应用逐渐称为小麦分子育种的重要研究内容[39]。魏景欣等[3]和时佳等[18]研究表明，TaPod-D1b和TaPod-A1a基因型与低POD活性相关，TaPod-D1a和TaPod-A1b基因型与高POD活性相关。研究用TaPod-A1和TaPod-D1小麦POD活性基因的功能标记对新疆小麦品种(系)进行检测，发现TaPod-A1等位变异和TaPod-D1均与POD活性呈极显著正相关，其中具有TaPod-A1b等位变异材料的POD活性显著高于具有TaPod-A1a等位变异的材料，具有TaPod-D1b等位变异材料的POD活性显著高于具有TaPod-D1a等位变异的材料。时佳等[18]利用TaPod-7D1和TaPod-7D6标记对243份中国小麦材料进行了检测，结合POD活性表型数据分析，却发现具TaPod-D1a等位变异的材料具有更高的POD活性，研究结果与其研究结果不一致，主要原因是POD的活性受遗传因子、生态环境和栽培措施等影响[15]，李凤梅等[40]研究表明，微效基因以及环境和其他植物生长调节剂影响甜瓜性型；曹雪莲等[41]发现基因间的互作及其与环境的互作对于小麦的抗穗发芽的影响较大；时佳等[42]通过产量功能标记检测时，也发现同一功能标记会因为环境及材料不同等原因，造成同一功能标记在不同研究中出现没有显著差异甚至结果相反的现象。因此，在今后的工作中可通过扩大样本量、提高样本的遗传多样性，对TaPod-D1位点不同等位变异与POD活性相关性进行深入研究，将基于TaPod-D1基因开发的功能标记应用育种实践。

4 结 论

在新疆小麦品种(系)材料中，以2个低POD活性等位变异类型TaPod-A1a和TaPod-D1a为主，且2个高POD活性等位变异类型TaPod-A1b/TaPod-D1b所占比例较少。TaPod-A1的功能标记POD-3A1和POD-3A2能较好的区分小麦籽粒POD活性的高低，可用于POD活性的分子标记辅助选择。TaPod-D1功能标记POD-7D1和POD-7D6标记结果与POD活性测定结果相对于前人TaPod-D1a为高POD活性等位变异的结论不一致，该标记仍需扩大材料做进一步验证。将2个功能标记组合使用，能更有效地筛选出高POD活性材料。