姜 山，时 爽，单万亭，鞠爱霞，李秋红

(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

2019年末，一种新型冠状病毒导致的肺炎在湖北武汉暴发，随后蔓延至全国。此次发现的新型冠状病毒为β属与2003年发现的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus)和2012年发现的中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus)为同一种属[1]，是继HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV之后第七种已知的人类冠状病毒。COVID-19的传播能力强，途径广，可通过飞沫、接触，以及密闭环境中可能通过气溶胶传播。人群普遍易感，轻症患者多出现低热、轻微乏力，无肺炎表现等症状；重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征，引起代谢紊乱、休克、器官衰竭甚至死亡。

国家卫健委指出，根据数据信息提示，总体上我国本轮疫情流行高峰已经过去。但是，在世界范围内，COVID-19疫情仍十分严峻，多个国家相继大范围暴发，截至2020年3月10日24时，我国累计报告确诊病例80 778例，境外确诊病例已超3万人，感染数量已经超过了2003年SARS的暴发[2]。目前，仍未发现治疗COVID-19的特效药，我国主要采用中西医结合的治疗方法，西医主要使用α-干扰素、利巴韦林等开展诊疗，中医则以清肺排毒汤等根据病情、各地气候特点以及患者体质的不同辨证论治。

麻杏甘石汤出自张仲景所著的《伤寒论》中，方剂由15 g麻黄、15 g杏仁、10 g甘草、30 g石膏组成，本方主要是治疗太阳病汗下后，邪气内传于肺，肺热奎滞，气逆而喘，具有辛凉疏表、清肺平喘的功效，可广泛用于治疗外感发热、肺炎咳喘、支气管哮喘、肺气肿等疾病[3]。国家卫健委和国家中医药管理局联合发布的中药复方清肺排毒汤中也包含麻杏甘石汤，方中麻黄为主药，能发汗宣肺；重用石膏为辅，可清泻肺热；杏仁宣利肺气为佐，助麻黄以止咳平喘；甘草调和诸药为使[4]。麻杏甘石汤在治疗呼吸道疾病的同时又有抗炎、抗流感病毒、调节免疫功能的作用[5]。

网络药理学是基于系统生物学和生物信息学的理论，建立在高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及网络数据库检索基础上实现新药设计和药物作用机制挖掘的学科。阐释疾病的发生发展过程，从改善或恢复生物网络平衡的整体观角度认识药物与机体的相互作用并指导新药发现。分子对接则是利用计算机模拟配体与受体蛋白结合，结合自由能表示结合能力的强弱，自由能越小表示配体和受体相互匹配作用越佳[6]。本研究预测麻杏甘石汤中的核心活性化合物，并对中药-化合物-靶点进行分子对接和网络药理学分析，为新药研发及治疗COVID-19提供依据。

1 方法

1.1 麻杏甘石汤活性成分数据库的构建基于TCMSP数据库(http://tcmspw.com/)获取麻杏甘石汤中的成分信息，以“麻黄”“杏仁”“甘草”“石膏”为关键词进行检索，筛选条件OB≥30%，且DL≥0.18[7]的化学成分作为活性成分并收集相关靶标蛋白。

1.2 C-T网络构建及PPI分析与麻杏甘石汤相关的所有靶标均从TCMSP数据库中收集，随后通过将类型限制为“人源”，在UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库中提取基因的正式名称，借助Cytoscape3.7.1软件建立C-T网络，对网络中的活性化合物和靶点初步分析。将活性化合物对应的靶点蛋白导入STRING平台(https://string-db.org/)，获取蛋白相互作用的关系。

1.3 生物学及通路富集分析麻杏甘石汤的作用靶点使用GO富集和KEGG通路分析，基于注释、可视化等模块在DAVID数据库进行分析(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)。P<0.05提示富集具有统计学意义，且通路结果可能是麻杏甘石汤治疗COVID-19的重要功能机制，得到的数据运用R软件绘制柱状图和气泡图。

1.4 分子对接分析分子对接的结合能为负表明配体与受体可以自发结合，研究选取结合能≤-5 kJ·mol-1的活性成分[8]作为麻杏甘石汤治疗COVID-19靶点的筛选依据。选取SARS-CoV-2 3CL水解酶和 ACE2做为分子对接的靶蛋白，并借助PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获取3D结构，使用TCMSP数据库下载化合物的3D结构保存为*mol2格式，TCMSP数据库未找到的化合物用ChemOffice软件构建化合物的3D结构并使其能量最小化作为分子对接配体。利用PyMOL软件、Auto Dock软件处理化合物及靶蛋白后用vina进行对接。

2 结果

2.1 活性成分及靶蛋白的筛选根据OB≥30%，DL≥0.18，筛选出化合物134个，其中23个来自麻黄，19个来自杏仁，92个来自甘草，石膏的化学成分并未在数据库中检索到，部分活性化合物基本信息见Tab 1。

Tab 1 Basic information of active compounds of Maxingganshi decoction

2.2 C-T网络及拓扑分析中药-化合物-靶点网络总共包括345个节点和1936条边，网络中红色菱形、蓝色三角形、绿色椭圆形、黄色平行四边形、紫色六边形、青色八边形分别代表麻黄、杏仁、甘草、麻黄和杏仁共有、麻黄和甘草共有、杏仁和甘草共有的化合物，深黄色长方形代表靶点(Fig 1)。通过分析化合物-靶点之间的中心度值、亲中心度值以及等级值发现，排名在前6位的化合物分别是槲皮素、山奈酚、柚皮素、豆甾醇、木犀草素、甘草黄酮，分别能与274、104、64、54、51、42个靶点蛋白发生相互作用。靶点方面，排名前列的是PTGS2、ESR1、PPARG、AR、NOS2、NCOA2，分别能与108、84、75、74、72、65个化合物发生相互作用；从靶点相互作用的角度，排名靠前的是AKT1、MAPK3、IL6、VEGFA、JUN、CASP3、MAPK8，分别能与136、121、120、110、104、103、101个蛋白发生相互作用(Fig 2)。通过网络分析发现，麻杏甘石汤中所含化合物在不同中药中均存在，借助Venny 2.1在线平台绘制韦恩图(Fig 3)，分析发现MOL000098槲皮素、MOL000422山奈酚、MOL004328柚皮素为麻黄和甘草所共有；MOL000449豆甾醇、MOL000492(+)-儿茶素为麻黄和杏仁所共有；MOL002311甘醇、MOL000359谷甾醇、MOL004841甘草查耳酮B、MOL000211丁子香萜、MOL004908甘草黄酮、MOL004903甘草苷、MOL005017菜豆酚为杏仁和甘草所共有。

Fig 1 Chinese medicine herb-compound-target network of Maxingganshi decoction

Fig 2 Number of adjacent nodes at target

Fig 3 Distribution of compounds in Maxingganshi decoction

2.3 靶点富集分析DAVID中GO功能富集分析得到GO条目226个(P<0.05)，其中生物过程(biological process, BP)条目165个，细胞组成(cellular component, CC)条目24个，分子功能(molecular function, MF)条目37个，分别占73%、10.6%、16.4%(Fig 4)。KEGG通路富集筛选得到65条信号通路(P<0.05)，涉及PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、T细胞受体信号通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用等，见Tab 2和Fig 5。

Tab 2 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.4 分子对接结果分析一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大。分子对接结果显示麻杏甘石汤中核心活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶有较好的结合活性，见Tab 3和Fig 6。

Tab 3 The binding affinities of core compounds of Maxingganshi decoction and clinical treatment drugs with SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

Fig 4 GO enrichment analysis of targets of Maxingganshi decoction

Fig 5 Analysis of KEGG enrichment in 20 pathways as targets of Maxingganshi decoction

Fig 6 Molecular docking of SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2 with glabridin and kaempferolA: glabridin-SARS-CoV-2 3CL hydrolase; B: kaempferol-SARS-CoV-2 3CL hydrolase; C: glabridin-ACE2; D: kaempferol-ACE2

3 讨论

目前，根据各地病例信息和临床疗效的数据统计显示，中医药对于COVID-19的治疗起到了重要的作用，中医学认为，“正气存内，邪不可干”，在没有特效药的情况下，广泛宣传“治未病”的理念，未病先防，已病防变，提醒人们增强自身免疫力，共同抗击疫情。国家卫健委已将新冠肺炎纳入“疫病”的范畴，由感受疫疠之气所致。新冠肺炎疫情具有强烈的传染性和大面积流行的特征，属于中医上“瘟疫”的范畴。瘟疫是病毒通过口鼻侵入造成呼吸道感染而致病，导致肺部细胞受损，如若正气不足免疫力低下则使病情加重，肺部细胞大量坏死，轻者发热、咳嗽、咽痛、胸闷、气促、喘息、乏力，重者肺部纤维化导致呼吸困难甚至衰竭，最终威胁生命[9]。中医药历经数代疾病，面对COVID-19的治疗也有足够的经验，并在此次疫情中起到了很好的治疗作用和不可替代的地位，通过分析中医治疗的推荐处方，可以在现阶段对COVID-19的临床治疗处方中，明显的看出是通过麻杏甘石汤的基础方剂上进行适当改变用药的。

麻杏甘石汤中麻黄可宣肺散寒，杏仁能宣散肺气，甘草用于调和诸药，石膏有清热之功效，此方为千古以来治疗风温肺热病(肺炎)的主要方剂，针对表寒肺热，可表里双治。从网络药理学的分析中发现，将麻杏甘石汤中综合评分最高的6个化合物同目前临床治疗应用的化学药与SARS-CoV-2 3CL水解酶进行分子对接研究，这些关键化学成分具有接近甚至超越化学药的结合能力，特别是甘草黄酮和山奈酚均低于利巴韦林、利托那韦等化学药的结合能。根据文献报道，SARS-CoV-2病毒是ACE2作为进入受体，通过受体介导的胞吞作用感染肺泡上皮细胞而引起肺炎[10]。故将方剂中关键化学成分及西药与ACE2进行分子对接比较，结果显示甘草黄酮的结合能为-28.42 kJ·mol-1，低于全部化学药的结合能，其他关键化学成分的结合能也较化学药相比有不同程度的降低。通过网络药理学和分子对接技术结果表明麻杏甘石汤对于治疗COVID-19应该有较好的疗效。

通过KEGG通路富集分析发现，结果大多涉及免疫系统、内分泌系统及与炎症相关的通路，SARS-CoV-2病毒感染会引起剧烈的免疫及炎症反应，并激活大量细胞因子，其中Th17细胞的主要功能是促进中性粒细胞的动员、募集和活化，介导促炎症反应，一系列细胞因子如TGF-β、IL-6、IL-9、IL-1、IL-23、IL-21、IRF4、STAT3参与了Th17细胞分化过程[11]。IL-17是Th17细胞的关键效应因子，能够引起多种细胞合成并分泌IL-6、IL-8等细胞因子，使ICAM-1的表达上调，从而导致炎症的产生[12]。麻杏甘石汤的多靶标可能是通过调控免疫相关通路以及细胞炎症因子作用相关通路，对免疫以及炎症反应进行抑制。

据载，生石膏主要应用于外感热病所致的肺热咳喘，而且肺热咳喘是COVID-19 的主要症状之一[13]。但其未收录在TCMSP数据库中，故未收集此药物。而其主要成分硫酸钙与SARS-CoV-2 3CL 水解酶进行分子对接，实验结果并不理想，因此硫酸钙未纳入麻杏甘石汤治疗 COVID-19 的核心活性化合物。

综上所述，我们通过对麻杏甘石汤网络药理学分析预测，麻杏甘石汤的治疗作用可能是通过活性物质对炎症相关信号通路的调控机制有关，如PI3K/AKT通路。有必要对麻杏甘石汤进行进一步的验证实验研究，探讨其关键作用机制。