刘 琪，张巧琳，陈晓芸，严尚学，吴华勋，魏 伟

(安徽医科大学临床药理研究所, 抗炎免疫药物教育部重点实验室，抗炎免疫药物安徽协同创新中心，安徽 合肥 230032)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)主要损伤关节及滑膜组织，炎症细胞的增多、滑膜增生以及血管翳的产生[1]，使关节畸形失去功能[2]。病程迁延难愈[3]，RA发病机制较为复杂，尚无理想的安全高效的治疗方法，对其深入研究具有重要意义。在研究RA病理机制时常用大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)模型，其优点在于建模方法简单，发病较为迅速。此外大鼠AA在关节肿胀及淋巴细胞浸润等方面的表现与RA患者相似[4]，为研究RA提供了合适的动物模型。对RA进行研究时，研究者倾向于研究与此相关的疾病机制与治疗方法等方面，较少涉及影响成模的因素问题。

某些与自身免疫有关的疾病发生率女性通常较男性高[5]，RA的发病率也是如此，这暗示了性别因素可能影响了RA的发病过程。这可能与女性对免疫具有较高的反应或与性别激素相关[6]。为探讨性别因素在AA大鼠临床表现和病理表现中的差异，选用雄性和雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，在足跖皮内注射完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant，CFA)，含卡介苗10 g·L-1诱导大鼠AA模型，成模后对雄性和雌性大鼠的AA成模情况(全身表现及病理评分)进行分析。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂SD大鼠购自安徽省实验动物中心，生产许可证号码：SCXK(皖)2011-002。选取32只SPF级、体质量为180 g左右的雌雄SD大鼠，于SPF级实验室饲养(安徽省实验动物中心)。动物实验计划由安徽医科大学临床药理研究所动物伦理委员会同意实施。试剂：CFA购自Chondrex inc公司。

1.2 AA模型的建立取含卡介苗10 g·L-1的CFA 100 μL，在大鼠的右后足足跖皮内注射建立模型。正常组选择注射100 μL的生理盐水。

1.3 动物分组综合全身指标的评分，d 15,随机将成模大鼠分为2组(每组8只)，即雄性和雌性大鼠模型组；设立2组正常组(每组8只)即雄性和雌性大鼠正常组。共计4组。

1.4 体质量和全身评分测定造模前(d 0)及造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)称量体质量。观察全身表现，进行全身评分[7]。

1.5 大鼠足爪肿胀度测定非致炎侧(左后足)足爪容积在造模前(d 0)与造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)测定，求出继发侧(左后足)的足爪肿胀度[8]。

1.6 大鼠关节肿胀数和炎症指数评分观察造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)大鼠发生的病变状况，记录关节肿胀数和炎症指数评分[7]。

1.7 病理学观察d 28大鼠全部处死，对其踝关节和脾脏进行病理评价[9]。

2 结果

2.1 构建雄性和雌性大鼠AA模型大鼠在产生炎症后的18 h，右后足爪出现肿胀高峰，3 d后炎症反应下降，d 9后再次发生肿胀；继发病变在致炎后d 14出现红肿现象；d 21左右，前后肢肿胀(Fig 1A-C)，尾根部及鼻翼附近产生结节(Fig 1D-E)；在成模过程中，雄性和雌性大鼠关节出现肿胀、精力颓靡和活动受阻等，提示造模成功。

Fig 1 Secondary inflammation of rat AA(n=8)

2.2 雄性和雌性大鼠体质量的变化情况从d 14开始，模型组大鼠体质量随炎症的严重程度下降。模型组大鼠的体质量因炎症的产生明显低于正常组同性别的大鼠，d 21后处于平稳状态。对模型组雄性和雌性大鼠的体质量比较发现，雌性大鼠的体质量明显下降(Fig 2)。

Fig 2 Changes in body weight of male *P<0.05,**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats;#P<0.05,##P<0.01 male model group rats vs female model group rats

2.3 雄性和雌性大鼠足爪的肿胀状况正常组和同性别模型组大鼠的足爪肿胀度比较结果显示，d 14开始，模型大鼠足爪肿胀度明显升高(Fig 3)，模型组雄性和雌性大鼠之间差异并未有显著性。

Fig 3 Changes of paw swelling in male *P<0.05,**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats

2.4 雄性与雌性AA大鼠关节肿胀数、关节炎指数和全身评分的变化情况雄性、雌性模型组d 7开始关节肿胀数均明显升高，d 21左右达高峰，d 24后关节肿胀数、关节炎指数与全身评分逐渐下降，雄性和雌性大鼠评分差异均无显著性(Fig 4)。

Fig 4 Changes of joint swelling, arthritis index and systemic score in male and female AA rats A:Effect on joint swelling; B:Effect on arthritis index;C:Effect on arthritis global assessment

2.5 雄性和雌性大鼠踝关节病理评分变化情况病理切片显示，在大鼠AA模型中关节滑膜细胞增生，有血管翳以及炎症细胞大量浸润(Fig 5A-D)。对踝关节进行病理观察发现：模型组中雄性和雌性大鼠的滑膜细胞增殖情况变多，在骨侵蚀、炎症细胞浸润、血管翳及炎症的严重程度较正常组严重且差异有显著性(Fig 6A-E)。在对模型组雄性和雌性大鼠之间进行比较发现，在骨质侵蚀与炎症方面雄性和雌性大鼠之间差异有显著性且雌性大鼠的严重程度高于雄性大鼠(Fig 6B,E)。

Fig 5 Pathomicrographs of ankle joints in rats A: Normal male rats (♂); B: Female normal rats (♀); C: Male model rats (♂); D: Female model rats (♀).Arrow a: Synoviocytes hyperplasia; arrow b: Inflammatory cell infiltration; arrow c: Bone erosion

Fig 6 Changes of ankle joint pathological scores in male and female rats n=8)A: Synoviocytes hyperplasia; B: Bone erosion; C: Cell infiltration; D: Pannus; E: inflammation.**P<0.01 rats in normal group vs rats of the same gender model group;#P<0.05,##P<0.01 male model group rats vs female model group rats

2.6 雄性和雌性大鼠脾脏病理评分变化情况病理切片结果显示，在大鼠AA模型中蓝染的淋巴细胞聚集范围扩大(Fig 7A-D)。对脾脏进行病理观察发现，模型组大鼠的淋巴结出现增生现象，生发中心的数量变多且与正常组大鼠差异有显著性(FIG 8A,C,E)。模型组中雄雌进行比较的结果显示，雄性和雌性大鼠的动脉周围淋巴鞘细胞的密度、边缘区增生与生发中心数量差异有显著性，雌性大鼠的炎症程度较雄性大鼠严重(Fig 8A,C,E)。

Fig 7 Micrographs of spleen in rats n=8)A: Male normal group rats (♂); B: Female normal group rats (♀); C: Male model group rats (♂); D: Female model group rats (♀).Arrow a: Germinal center, arrow b: Marginal zone hyperplasia; arrow c: Red pulp hyperplasia; arrow d: Periarterial lymph sheath

Fig 8 Changes in spleen pathological scores in male and female n=8)A: Periarterial lymphatic sheath; B: Lymph node hyperplasia; C: Marginal zone hyperplasia; D: Red pulp hyperplasia; E: Germinal center.**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats;#P<0.05,##P<0.01 male rats in model group vs female rats in model group

3 讨论

RA的发病机制可能与遗传、生活方式等多因素有关。

研究疾病的机制需选用合适的动物模型，可模拟条件显示出与人类疾病相似的状态。大鼠AA模型与RA患者的疾病特征类似且具有发病快、模型制备方法简单等优点，常作为研究RA病因或治疗手段等的重要工具[10]。在RA疾病中存在性别差异，可能是女性对体液免疫有较强的反应与性激素共同影响的结果[6]，雌激素可双向影响细胞免疫，当体内雌激素含量升高时(分娩前)患有RA的患者疾病症状减轻，当含量降低时(分娩后)，又呈现出原有的疾病症状[11]。细胞免疫与体液免疫反应对RA的发病有一定的影响[12-13]。

为探讨在动物模型中是否因雌雄差异而引起疾病严重程度的不同，采用雌雄年龄、体质量相近的SD大鼠，经10 g·L-1的CFA诱导后构建AA模型，大鼠在产生炎症后的18 h，足爪出现肿胀高峰，d 9左右再次发生肿胀；继发病变在致炎后d 14左右出现红肿现象；d 21左右达炎症高峰，炎症发生较为迅速；模型组雌性大鼠的体质量较雄性大鼠轻，可能与雌性大鼠对炎症的反应强烈，食欲减退，抵抗力下降有关；在对关节与脾脏的一系列评分发现，雌性大鼠的炎症严重程度较雄性大鼠深，且差异有显著性，与RA女性患者发病率较男性高的研究结果相吻合。本实验所构建的大鼠AA模型，雌性与雄性大鼠的疾病严重程度在临床表现与病理方面存在差异，雌性大鼠更易于诱导模型。然而在大多数实验中，研究者采用雄性大鼠，可能与排除性激素的干扰及雌性大鼠抵抗力低，死亡率较雄性大鼠高有关。期望本文能对研究RA雄性与雌性的大鼠选择提供新的参考依据，从而更加全面地研究RA。