1. 新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046;2. 新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830004

阿尔泰金莲花Trolliusaltaicus是毛茛科金莲花属多年生草本植物，主要分布于我国新疆阿勒泰、塔城地区，具有清热解毒、止血止咳等功效，其干燥花蕾在临床上多用于上呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃体炎等疾病的治疗，收载于《哈萨克药志》等医药文献中[1-2]。黄酮碳苷类化合物是该药材主要特征性化合物，其中以荭草素2″-O-β-L-半乳糖(OGA)的含量最高[3-5]。然而，对该化合物的研究文献报道较少。因此，在前期研究基础上，本实验拟通过Box-Behnken中心组合实验设计优化阿尔泰金莲花OGA的纤维素酶辅助超声提取工艺，为阿尔泰金莲花及其OGA的开发利用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-10ATvp 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AL204 型分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；AS系列超声波清洗机(天津欧特赛恩斯仪器有限公司)；DZKW-S-4电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；SHB-III 型循环水式多用真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)；ST-02A 型小型粉碎机(永康市帅同工具有限公司)。

1.2 材料 阿尔泰金莲花药材于2018年7月采自新疆阿勒泰地区，经新疆药物研究所何江研究员鉴定为阿尔泰金莲花T.altaicus的干燥花蕾，药材粉碎，过40目筛。荭草素2″-O-b-L-半乳糖苷对照品(OGA，上海源叶生物科技有限公司，纯度为98.0%)；纤维素酶(4×105U/g)购自上海如吉生物科技发展有限公司；色谱纯乙腈和甲醇分别购自美国 Fishe公司)；去离子水(乌鲁木齐市雪白真纯净水有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法及结果

2.1 阿尔泰金莲花OGA的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)：0.2%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱程序(0 min～10 min～15 min～20 min，15%A～19%A～25%A～15%A)；柱温30℃；流速1.0 mL/min；检测波长345 nm；进样量 10 μL。

2.1.2 标准曲线绘制 精密称取OGA对照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，制备成浓度为 0.20 mg/mL 的OGA对照品溶液。精密吸取OGA对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。进样10 μL，记录峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，OGA 质量浓度(mg/mL)为横坐标(X)，进行线性拟合，得回归方程为Y=1.690357752×107X+5.02805594×104，R2=0.9999，表明样品在 0.002～0.1 mg/mL浓度范围内对照品色谱峰面积与OGA质量浓度线性关系良好。

2.1.3 OGA的含量测定 取一定量阿尔泰金莲花样品，加入一定量的纤维素酶后，加入乙醇溶液，超声提取后，灭酶(沸水浴5 min)，过滤，滤液进液相，记录峰面积，计算阿尔泰金莲花OGA提取率(W)。

式中：W为 OGA提取率(%)；C为提取液中OGA浓度(mg/mL)；D为溶液稀释倍数；V为提取液体积(mL)；m为药材质量(g)。

2.2 单因素考察

2.2.1 pH的确定 称取药材5份，每份1.0 g， 其中5份加入1.0%的纤维素酶，另外5份不加酶作为对照。每份样品加入50倍量50%乙醇，以盐酸缓冲液调 pH分别为 3、4、5、6后，于40 ℃功率90 W条件下超理 30 min酶解，灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图1所示，在不同pH条件下，纤维素酶对OGA提取率的影响不同。随着pH的增加，提取率呈现先增后降的趋势、pH为4 时OGA提取率最高，过后逐渐降低，且加纤维素酶的提取率明显高于不加酶的。

图1 pH值对OGA提取率的影响

2.2.2 酶添加量对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，分别加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的纤维素酶后，加入50倍量50%乙醇，以盐酸缓冲液调pH为4，于40℃功率90W条件下下超声30 min后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。从图2可以看出，随着酶添加量的增大，提取率呈增长趋势，当酶添加量为1.5%时，提取率达到最高，大于1.5%后，提取率逐渐降低。

图2 酶添加量对OGA提取率的影响

2.2.3 料液比对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，每份样品加入1.5% 的纤维素酶后，分别加入料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的50%乙醇，以盐酸缓冲液调 pH为4，于40 ℃功率90 W条件下超声30 min酶解后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图3所示，随着料液比的增大，OGA提取率逐步增大，当料液比为1∶40 时，提取率达到最高值，之后略有下降。

图3 料液比对OGA提取率的影响

2.2.4 乙醇浓度对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，每份样品加入1.5%的纤维素酶后，分别加入50倍量30%、40%、50%、60%、70%乙醇，以盐酸缓冲液调pH为4，于40 ℃功率90 W条件下超声30 min酶解后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图4所示，随着乙醇浓度(30%～50%)的增加，OGA提取率不断增加，当乙醇浓度为50%时，提取率达到最高，随着乙醇浓度的增大，提取率缓慢下降，可能是由于乙醇浓度的增加使提取液中杂质增多，限制了OGA的溶出，致使其提取率下降。

图4 乙醇浓度对OGA提取率的影响

2.2.5 超声温度对OGA提取率的影响 称取药材1.0 g 5份，分别向其中加入1.5%的纤维素酶、50倍量50%乙醇，并以盐酸缓冲液调 pH为4，于35、40、45、50、55 ℃，功率为90 W条件下超声处理30 min酶解后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。从图5可以看出，温度为40℃时，OGA提取率最高。温度过高会导致酶变性失活，也会对有效成分造成一定程度的破坏。

2.2.6 超声时间对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，分别加入1.5%纤维素酶、50倍量50%乙醇，且以盐酸缓冲液调pH为4，于40℃，功率90W条件下超声处理10、20、30、40、50 min后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。超声时间短会影响酶解效果，时间过长不利于工业化生产，因此选择合适的超声时间对酶发挥最大作用和节约时间有双重作用。从图6可以看出，在超声时间为40 min时，OGA提取率达到最高，之后，随着超声时间的增加，提取率反而呈下降趋势。

图5 提取温度对OGA得率的影响

图6 提取时间对OGA提取率的影响

2.2.7 超声功率对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，分别加入1.5%维素酶、50倍量50%乙醇，且以盐酸缓冲液调 pH为4，在40℃功率分别为90、132、174、216、258、300 W条件下超声处理30 min后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图7所示，随着超声功率的增加，OGA提取率整体呈下降趋势，当超声频率为 90 W时，提取率为最高。故选择提取的超声频率为90 W。

图7 超声功率对OGA提取率的影响

2.3 响应面试验设计及优化结果 结合单因素试验分析结果，依据Box-Behnken中心组合原理，优化酶辅助超声提取阿尔泰金莲花OGA的提取工艺条件。选择酶添加量、乙醇浓度、超声时间和超声温度四个因素为自变量，每一自变量的试验分别以-1、0、1编码，以OGA提取率(%)为响应值，进行四因素三水平实验，利用Design-Expert 8.05软件对试验多元线性回归和二项式拟合，并对拟合方程进行方差分析。因素水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 响应面试验设计因素与水平

表2 响应面试验设计及结果

以OGA提取率为指标，通过Design-Expert V 8.05软件对表中试验数据进行多元回归拟合，获得OGA提取率(Y)对酶添加量(A)、乙醇浓度(B)、超声时间(C)和超声温度(D)四因素的二次多项回归模拟方程为：Y=+2.77-0.020×A-0.052×B-0.018×C-0.019×D- 0.015×D-0.042×AB-0.048×AC-5.500E-003×AD+1.250E-003×AD-0.070×BC-8.750E-003×BD+1.667E-003×BD+4.500E-003×CD+0.014×CD-0.063×A2-0.065×B2-0.044×C2。

表3 方差分析

对该模型进行方差分析，结果如表3所示，该回归模型F值0.15，P<0.0001，方程模型达到极显著；决定系数R2=0.9582，校正系数AdjR2=0.8937；失拟项大于0.05，失拟不显著，说明回归方程拟合状态良好；变异系数CV为0.9%，表明模型的重现性很好；因此可以利用此模型优化阿尔泰金莲花OGA的酶辅助超声提取条件。B、C的P值均小于0.01，说明乙醇浓度和提取时间对OGA提取影响极显著。各因素对OGA得率影响大小顺序为B>C>A>D。而AD、BD、CD的P值大于0.05，表明他们之间的作用对OGA提取率没有显著性影响。AB、AC、BC的P值小于0.01，说明酶添加量和乙醇浓度、提取时间，乙醇浓度和提取时间之间有明显的交互作用。不同因子交互作用的响应面分析图如图8所示。通过 Design Expert 8.0.5 软件分析得出阿尔泰金莲花OGA纤维素酶辅助超声提取的最佳工艺条件为：酶添加量1.50%，乙醇浓度48.49%，超声时间38.31 min，超声温度40 ℃；在此工艺条件下，阿尔泰金莲花理论预测提取率为2.81%。

2.4 验证试验 为检验响应面法优化后工艺的可靠性以及考虑实验操作的可行性，结合单因素实验结果，将上述提取工艺条件确定为：酶添加量1.50%，乙醇浓度48.0%，超声时间38.0 min，超声温度40.0 ℃。在此条件下，进行3 组平行试验，获得阿尔泰金莲花OGA提取率的均值为(2.79±0.03)%，与理论值的相对误差为0.2%，回归方程的预测值与实际实验值相一致，说明运用响应面法优化得到的模型参数可靠准确，可真实地反映各因素对阿尔泰金莲花OGA提取率的影响。

图8 各因素交互作用对阿尔泰金莲花OGA得率影响的响应面图

3 讨论

阿尔泰金莲花荭草素2″-O-β-L半乳糖苷(OGA)是连接有两个糖的黄酮碳苷类化合物，水溶性较大，故采用低浓度的乙醇就可以将其较好的提取出来。然而乙醇浓度过低，会使过多水溶性杂质也被提取出来，导致其提取率降低；乙醇浓度过高，其溶解性降低，亦会减少提取率。在乙醇浓度为50%左右的提取条件下，提取率最高，验证了这一推断。采用纤维素酶辅助超声波萃取法对OGA进行了提取工艺优化研究。该工艺通过纤维素酶水解破坏阿尔泰金莲花的细胞壁，且在超声作用下，药材中所含黄酮类成分大量渗出，提取液中OGA含量得到较大提高。本研究以单因素实验结果为基础，通过响应面分析优化出阿尔泰金莲花OGA的纤维素酶辅助超声提取工艺，较优工艺条件为：pH为4、料液比1∶40、超声功率90W、酶添加量1.5%、乙醇浓度48.0%、超声时间38.0 min、超声温度40.0 ℃，在此工艺条件下阿尔泰金莲花OGA提取率可达2.7%以上；且该方法简单高效、成本低、易于操作。研究结果可为阿尔泰金莲花及其OGA的深入研究提供基础资料。