杨立国 新 红2 陈香梅1 达拉胡3 苏都那布其2 王秀兰

1. 内蒙古民族大学蒙医药学院, 内蒙古 通辽 028000;2.内蒙古蒙医药工程技术研究院,内蒙古 通辽 028000;3.内蒙古通辽市库伦旗蒙医医院,内蒙古 通辽 028000

棘豆属植物全世界约300余种，主要分布在北半球，我国约150余种，分布在东北、华北、西北等地[1]。蒙医药中常用的是其中的多叶棘豆和硬毛棘豆，二者均收载于《中华人民共和国卫生部药品标准-蒙药分册》(1998年版)：多叶棘豆为豆科植物多叶棘豆OxytropismyriophyllaDC.的干燥全草，味苦、甘，性凉、钝、轻、糙，具有杀“粘”、清热、燥“协日乌素”，愈伤、生肌、锁脉、止血、消肿、通便的功效；硬毛棘豆为豆科植物硬毛棘豆OxytropishirtaBge.的干燥地上部分，味苦、甘，性凉、钝、轻、糙，具有杀“粘”、清热、燥“协日乌素”、愈伤、生肌、锁脉、止血、消肿、通便的功效[2]。据文献[3]报道，多叶棘豆和硬毛棘豆在临床上经常混用(如图1所示)。笔者前期已对多叶棘豆化学成分进行了综述[4]，另陈思有等[5]通过DNA条形码将多叶棘豆和硬毛棘豆进行鉴定，但多叶棘豆和硬毛棘豆显微特征、薄层色谱和HPLC特征图谱对比研究，均未见文献报道。多叶棘豆和硬毛棘豆总黄酮成分含量对比研究，仅有1篇文献[6]报道。鉴于上述研究现状，本实验拟以多叶棘豆和硬毛棘豆为研究对象，从显微特征、薄层色谱、HPLC特征图谱和总黄酮含量等方面对多叶棘豆和硬毛棘豆进行对比研究，以期为多叶棘豆和硬毛棘豆的合理应用提供参考。

图1 多叶棘豆(左)和硬毛棘豆(右)

1.1 仪器与材料 Nikon E200电子显微镜和DS-U3拍照装置(北京恒三江仪器有限公司)；多叶棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室；水合氯醛、稀甘油均为分析纯试剂。

1 显微特征对比研究

1.2 方法与结果 根据《中国药典》2015年版四部通则2001显微鉴别法[7]规定，取多叶棘豆和硬毛棘豆粉末适量，水合氯醛、稀甘油制片进行显微观察，生物光学显微镜下观察显微特征，结果如图2所示。由图2可知，多叶棘豆和硬毛棘豆药材粉末的导管均为螺纹导管和具缘纹孔导管，直径约8～45 μm；气孔为不定式气孔，类圆形或椭圆形，直径10～35 μm；纤维多成束，碎断，壁较厚，直径8～38 μm；木栓细胞直径约18～62 μm，二者(根部)均存在。综上所述，二者粉末显微特征基本相似，无显著差异，组织切片显微特征对比研究待进一步开展。

1～4分别为多叶棘豆导管、气孔、纤维细胞和木栓细胞；5～8分别为硬毛棘豆导管、气孔、纤维细胞和木栓细胞图2 粉末显微特征对比(10×40)

2 基于薄层色谱的多叶棘豆和硬毛棘豆对比研究

2.1 仪器与材料 硅胶G板(青岛海洋化工公司)；聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲塑料厂)；ZF-02S型紫外分析仪(北京君意东方电泳设限公司)；多叶棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室；槲皮素(117-39-5，上海源叶生物科技公司)；异鼠李素(480-19-3，上海源叶生物科技公司)；芦丁(153-18-4，上海源叶生物科技公司)；乙酸乙酯、甲醇、甲酸、冰醋酸均为分析纯试剂。

2.2 方法与结果 供试品溶液的制备：分别取多叶棘豆和硬毛棘豆1 g，加65%乙醇10 mL，加热回流2 h，滤过，滤液蒸干，残渣用1 mL甲醇溶解，备用。

对照品溶液的制备：分别取槲皮素、异鼠李素、芦丁0.5 mg，用1 mL甲醇溶解，作为对照品溶液，备用。

展开与检视：分别取多叶棘豆、硬毛棘豆、槲皮素、异鼠李素、芦丁溶液各3 μL，点于聚酰胺薄膜上，用甲醇-水-冰醋酸=12∶3∶3展开，取出，晾干，365 nm紫外灯下检视，结果如图3所示；分别吸取多叶棘豆、硬毛棘豆溶液各3 μL，点于硅胶G板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15∶1∶1∶2展开，取出，晾干，10%硫酸-乙醇显色，电吹风加热至斑点清晰，结果如图3所示。由图3可知，多叶棘豆和硬毛棘豆化学成分均很复杂，二者化学成分存在较大差异。

3 基于HPLC特征图谱的多叶棘豆和硬毛棘豆对比研究

3.1 仪器与材料 Ultimate 3000高效液相色谱仪(LC-20AT四元泵、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-M20A紫外检测器)；超声波清洗器SK8200 HP(上海科导超声仪器公司)；METTLER-TOLEDO AG-285型电子分析天平(METTLER-TOLEDO有限公司)；多叶棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室；乙腈为色谱纯；乙酸为分析纯；蒸馏水自制。

3.2 方法与结果 色谱条件：色谱柱为Waters Xterra MS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为乙腈-0.4%乙酸水溶液，梯度洗脱程序见表1；检测波长为260 nm；柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL。

左-聚酰胺色谱；右-硅胶色谱；1,6-硬毛棘豆，5,7-多叶棘豆，2-槲皮素，3-异鼠李素，4-芦丁图3 薄层色谱对比

表1 流动相梯度洗脱程序

供试品溶液的制备：分别取多叶棘豆和硬毛棘豆0.5 g，加65%乙醇10 mL，密塞，称定重量，超声处理40 min，取出，放冷，再称定重量，65%乙醇补足减失重量，摇匀，滤过。滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

HPLC特征图谱建立：分别吸取多叶棘豆、硬毛棘豆供试品溶液各10 μL，进样，按表1程序进行梯度洗脱，得到多叶棘豆和硬毛棘豆HPLC特征图谱，结果如图4所示。由图4可知，多叶棘豆和硬毛棘豆化学成分均很复杂，二者化学成分存在较大差异。

4 总黄酮含量对比研究

4.1 仪器与材料 FW-177高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器公司)；752-PC紫外-可见分光光度计；HW-526数显恒温水浴锅(上海恒科学仪器公司)；BS224 S分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；多叶棘豆Oxytropismyriophylla和硬毛棘豆Oxytropishirta采自内蒙古蒙医药工程技术研究院药草园，经内蒙古民族大学蒙医药学院吴香杰教授鉴定为正品，标本保存于内蒙古蒙医药工程技术研究院标本室；芦丁(153-18-4，上海源叶生物科技公司)；亚硝酸钠(天津市永大化学试剂公司)；硝酸铝(天津市大茂化学试剂公司)；氢氧化钠(天津市大茂化学试剂公司)；95%乙醇(天津市永大化学试剂公司)；其他试剂均为分析纯。

上为硬毛棘豆，下为多叶棘豆图4 HPLC特征图谱对比

4.2 方法[8]与结果

4.2.1 供试品溶液的制备 分别取粉碎过40目的多叶棘豆和硬毛棘豆药材粉末各5 g，加入50 mL 65%乙醇，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，65%乙醇补足减失的重量，过滤，摇匀，即得供试品溶液。

4.2.2 对照品溶液的制备 精密称定10.08 mg芦丁标准品，置于50 mL容量瓶中，加65%乙醇溶解，稀释至刻度，配制成0.2 mg/mL对照品溶液，冷藏备用。

4.2.3 标准曲线的绘制 从不同浓度(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL、0.12 mg/mL)芦丁标准品溶液中精密量取1 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min后，再加入10%硝酸铝0.3 mL，再静置6 min，最后加入4%氢氧化钠试液4 mL，加入65%乙醇至刻度，摇匀，静置15 min。采用紫外-可见分光光度法，以65%乙醇为参比溶液，在510 nm处测吸光度，以标准溶液浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程：Y=11.49X+0.0179，r2= 0.9990。结果表明，芦丁对照品在0.02～0.12 mg/mL范围内线性关系良好。如图5所示。

图5 芦丁标准曲线

4.2.4 方法学考察 精密度试验：精密吸取多叶棘豆供试品溶液1 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色并测定吸光度，连续测定6次，RSD为0.36%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：在室温下，精密吸取多叶棘豆供试品溶液1 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色后，放置0、5、10、15、20、25 min后测定其吸光度，计算RSD为2.29%，表明供试品溶液在25 min内稳定性良好。

重复性试验：取同一批多叶棘豆药材，照供试品溶液的制备方法制得6份供试品溶液，各取1 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色并测定吸光度，计算所得总黄酮的平均含量为0.332 mg/g，RSD为2.54%。表明该方法重复性良好。

加样回收率试验：精确吸取已知含量的多叶棘豆供试品溶液0.5 mL，共6份，分别加0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液0.5 mL，照“4.2.3”项下制备方法显色并测定吸光度，计算回收率。平均回收率为94.66%，RSD为2.46%，表明该方法具有良好的准确度。见表2。

表2 加样回收率实验结果

4.2.5 多叶棘豆和硬毛棘豆总黄酮含量测定 分别称取多叶棘豆5.0228 g和硬毛棘豆5.0218 g，按照前述方法测定多叶棘豆和硬毛棘豆中总黄酮含量。实验结果表明，多叶棘豆中总黄酮含量为0.552 mg/g，硬毛棘豆中总黄酮含量为0.793 mg/g。

表3 总黄酮含量测定结果

5 讨论

多叶棘豆和硬毛棘豆分别为豆科植物多叶棘豆OxytropismyriophyllaDC.和硬毛棘豆OxytropishirtaBge.的干燥全草，二者均具有杀“粘”、清热、燥“协日乌素”、愈伤、生肌、锁脉、止血、消肿、通便的功效，且二者在临床上经常混用[2-3]。本实验从显微特征、TLC、HPLC特征图谱和总黄酮含量四方面对多叶棘豆和硬毛棘豆进行对比研究，发现：①多叶棘豆和硬毛棘豆药材粉末显微特征无显著性差异；②二者的薄层色谱存在显著差异，硬毛棘豆化学成分更为复杂；③二者的HPLC特征图谱也存在不小差异，总体上讲，硬毛棘豆化学成分更为复杂，这与薄层色谱显示结果一致；④总黄酮含量方面，硬毛棘豆总黄酮含量(0.793 mg/g)高于多叶棘豆总黄酮含量(0.552 mg/g)。综上所述，多叶棘豆和硬毛棘豆在化学成分方面存在着一定的差别，建议临床医生谨慎选用。

另外，多叶棘豆和硬毛棘豆在蒙医临床中应用广泛[9]，但二者现行标准仍为1998版蒙药分册部颁标准，急需完善更新[10-11]，本研究可为二者质量标准修订完善工作提供一定的参考。