杨超，张彦收，张庚，杜凯邺，李静平，刘亮

1河北医科大学第四医院乳腺中心，石家庄 050011；2河北医科大学第四医院肿瘤研究所，石家庄 050011

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，发病率及病死率较高，严重威胁着女性的生命健康[1]。其常规治疗方法包括手术、化疗及放疗，其中手术仍是首选方法，但相当一部分患者就诊时已属中晚期，失去了手术治疗的机会。因此，化疗成为其主要的治疗方法之一。影响化疗效果的主要因素为化疗药物的毒副作用及耐药性。寻找高效低毒的抗乳腺癌药物对提高治疗效果、延长生存期具有重要意义。为了寻找低毒的抗癌药物，目前研究者多倾向于从中草药中寻找抗癌成分。中药治疗肿瘤历史悠久且低毒、价廉[2-3]。青蒿素来源于植物黄花蒿，其多种衍生物具有较好的抗疟作用[4-5]，如青蒿琥酯治疗重型及耐药型疟疾效果较好[6-9]，还具有调节免疫[10]、 抗炎、抗氧化[11]及抗肿瘤的作用[12]。有研究发现，青蒿琥酯具有抗多种肿瘤作用[13-16]，但其作用机制研究鲜有报道。本研究探讨青蒿琥酯对乳腺癌细胞的生长抑制作用及其机制，为将青蒿琥酯应用于临床治疗乳腺癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 注射用青蒿琥酯购自桂林南药股份有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染检测试剂盒购自美国Beckman Coulter公司；罗丹明123(Rhodanmine 123，Rho123)试剂购自中国Solarbio公司；CCK-8试剂购自中国博士德生物工程有限公司；Bcl-2及Bax抗体购自美国Santa Cruz公司；MatrigelTMMatrix Basement Membrane购自美国BD公司。Transwell 3422购自美国Corning公司；FC-500型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.2 细胞株 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231由本实验室传代培养。接种细胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中(补充青霉素、链霉素各100 U/L)，置于37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.3 细胞增殖抑制实验 取对数生长期的MDAMB-231细胞，调整细胞浓度至1×104/ml，接种于96孔细胞培养板中，置于37 ℃、5% CO2温箱中。贴壁后倒去培养液，分别加入不同浓度的青蒿琥酯(0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、400、800 μg/ml)，阴性对照组加入等体积培养液，反应总体积200 μl/孔。另设空白对照孔，只加培养液，每个药物浓度均设3个复孔，置于37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h后，每孔加入CCK-8溶液20 μl，继续孵育3 h，终止培养。用酶标仪测定各孔450 nm波长处的吸光度(A450)值，计算生长抑制率(IR)及半数抑制浓度(IC50值)。IR(%)=(1－用药组A450/对照组A450)×100%。

1.4 细胞实验分组及青蒿琥酯干预实验 取对数生长期的MDA-MB-231细胞(5×106个)接种于细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的青蒿琥酯，终浓度分别为0、25、50、100 μg/ml(根据IC50值选择)，0 μg/ml青蒿琥酯以生理盐水代替，作为对照组，作用24 h后，收集细胞，PBS液洗涤2次，300目尼龙网过滤制备成合格的单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml。每组实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况 取1 ml单细胞悬液，用预冷PBS洗涤1次，100 μl预冷1×结合缓冲液悬浮细胞，加入10 μl AnnexinV-FITC，冰上避光放置15 min，加入380 μl 1×结合缓冲液，然后加入10 μl PI染液冰上避光放置15 min，PBS洗涤1次，1 ml PBS悬浮细胞，上流式细胞仪检测细胞凋亡 情况。

1.6 流式细胞术检测细胞线粒体膜电位 取1 ml单细胞悬液，用预冷PBS洗涤1次，100 μl PBS液悬浮细胞，加入Rho123染料，终浓度为10 μg/ml，在37 ℃下避光平衡30 min，PBS洗涤1次，1 ml PBS悬浮细胞，采用流式细胞术检测细胞线粒体膜电位。以平均荧光强度表示细胞线粒体膜电位水平。

1.7 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 取对数生长期的MDA-MB-231细胞(5×106个)接种于细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的青蒿琥酯，终浓度分别为0、25 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理盐水代替，作为对照组，作用24 h后，收集细胞。

先用Marker笔在6孔板背后均匀划线，间隔0.5 cm，横穿过孔，每孔穿过5条线。在每孔中加入约5×105个上述制备细胞，培养过夜后融合度达到100%。第2天用10 μl枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头垂直，不能倾斜(不同孔之间使用同一只枪头)。PBS洗涤3次，去除划下的细胞，加入培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养并于0、24 h拍照。

1.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力 取对数生长期的MDA-MB-231细胞(5×106个)接种于细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的青蒿琥酯，终浓度分别为0、25 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理盐水代替，作为对照组，作用24 h后，收集 细胞。

用Matrigel和无血清RPMI 1640(1:8稀释)包被Transwell小室底部膜的上室面，每孔加入60 μl稀释后的Matrigel胶，37 ℃孵育4 h。此间Matrigel胶变为白色层，吸除培养板中残余液体，每孔加入50 μl无血清RPMI 1640，37 ℃孵育30 min，取上述收集的细胞去血清饥饿12 h后，向Transwell上室加入无血清RPMI 1640细胞悬液200 μl(含2×104个细胞)，下室加入600 μl全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，移去上室，用棉签擦去上室细胞，结晶紫染色，于100倍显微镜下计数迁移至下室的细胞数量(随机选取5个视野)。

1.9 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计分析。所有数据均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 青蒿琥酯可抑制乳腺癌细胞增殖 CCK-8法检测结果显示，青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞具有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性(图1)。青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞的IC50为54.24 μg/ml。根据青蒿琥酯对乳腺癌细胞的IC50值，后续实验青蒿琥酯浓度选择0、25、50及100 μg/ml，0 μg/ml青蒿琥酯以生理盐水代替，作为对照组。

图1 青蒿琥酯抑制MDA-MB-231细胞增殖曲线图(CCK-8， n=3)Fig.1 Curative curve of MDA-MB-231 cells treated with artesunate (CCK-8, n=3)

2.2 青蒿琥酯可诱导乳腺癌细胞凋亡 流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，25、50及100 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231细胞24 h，细胞凋亡率显著增高(P<0.01)，且呈浓度依赖性。100 μg/ml青蒿琥酯组细胞凋亡率显著高于25及50 μg/ml青蒿琥酯组(P<0.01，图2)。

2.3 青蒿琥酯可降低乳腺癌细胞线粒体膜电位 流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，25、50 及100 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231细胞24 h，细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.01)，且呈浓度依赖性。100 μg/ml青蒿琥酯组细胞线粒体膜电位显著低于25及50 μg/ml青蒿琥酯组(P<0.01， 图3)。

图2 青蒿琥酯诱导MDA-MB-231细胞凋亡(流式细胞术，n=3)Fig.2 Apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by artesunate (Flow cytometry, n=3)

2.4 青蒿琥酯可抑制乳腺癌细胞的迁移能力 细胞划痕实验检测结果显示，25 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231细胞24 h，可以显著抑制MDAMB-231细胞的迁移能力(图4)。

2.5 青蒿琥酯可抑制乳腺癌细胞的侵袭能力 Transwell实验检测结果显示，25 μg/ml青蒿琥酯作用于MDA-MB-231细胞24 h，侵袭细胞数(42.33±5.51)较对照组(126.00±9.54)明显减少(P<0.01，图5)。

3 讨 论

目前乳腺癌的常规治疗方法包括手术、化疗及放疗[17-20]，其中手术是首选的治疗方法，但由于诸多原因不能手术的患者往往会选择化疗及放疗[21]。影响化疗效果的因素主要包括药物的毒副作用及多药耐药，因此寻找高效低毒的抗乳腺癌药物具有重要意义。

图3 青蒿琥酯调控MDA-MB-231细胞线粒体膜电位(流式细胞术，n=3)Fig.3 Mitochondrial membrane potential in MDA-MB-231 cells regulated by artesunate (Flow cytometry, n=3)

中药治疗肿瘤历史悠久，具有低毒、高效、价廉的特点。从中草药中寻找抗肿瘤药物已成为目前肿瘤界研究的热点[22-24]。青蒿素来源于植物黄花蒿，其衍生物青蒿琥酯具有重要的药效价值。青蒿琥酯是经典的抗疟药物，具有低毒、高效的特点，对重型和耐药型疟疾疗效较好[25-27]。已知青蒿琥酯对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用[28-30]。本课题组前期研究发现，青蒿琥酯对食管癌及胃癌细胞具有生长抑制作用，且其抑制作用与诱导细胞凋亡有 关[31-32]。本研究主要探讨青蒿琥酯对乳腺癌细胞的生长抑制作用及可能机制，为其作为抗乳腺癌药物应用于临床提供理论依据。本研究发现，青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞具有生长抑制作用，且呈浓度依赖性。

细胞凋亡是受诸多因子调控的程序性细胞死亡，亦是判断药物是否具有抗癌作用的主要指标。线粒体是细胞生命活动的控制中心，细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，以及细胞凋亡的调控中心。线粒体跨膜电位下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，一旦线粒体跨膜电位剧变，则细胞凋亡将不可逆。本研究结果显示，青蒿琥酯作用后，MDA-MB-231细胞发生凋亡，且呈浓度依赖性；细胞线粒体膜电位进一步降低，且随着青蒿琥酯浓度增高，线粒体膜电位进一步降低。表明青蒿琥酯对乳腺癌细胞的生长抑制作用与诱导细胞凋亡作用有关，细胞线粒体膜电位降低，从而引起细胞凋亡。本研究还发现，青蒿琥酯可显著抑制MDAMB-231细胞的迁移及侵袭能力。

图4 划痕实验检测乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力(×100)Fig.4 The migration ability of MDA-MB-231 cells was detected by wound healing test (×100)

图5 Transwell实验检测乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力(×200)Fig.5 The invasive ability of MDA-MB-231 cells was detected by Transwell assay (×200)

综上所述，青蒿琥酯可抑制乳腺癌细胞的生长，降低线粒体膜电位，从而导致细胞凋亡；还可抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，来源于植物黄花蒿，具有低毒副作用的特点，若能将其开发为抗乳腺癌药物，将会有广泛的应用前景。