王武龙 汪艾曼 江振宇 胡琦 王春雷 韩忠丽 冯建国 张巧枝 杜艳红 高文斌

(1包头医学院第二附属医院肿瘤科，内蒙古 包头 014030；2包头医学院第三附属医院体检科；3包头医学院第二附属医院消化内科；4包头市肿瘤医院泌尿外科；5包头市第四医院甲乳外科；6包头市中心医院药剂科；7深圳大学第三附属医院肿瘤内科)

恶性浆膜腔积液是肿瘤疾病晚期常见的主要临床症状，多发生于腹腔、胸腔和心包腔内，主要见于胃肠道肿瘤、卵巢癌、肺癌等。临床统计发现，约半数的患者会以此作为最初临床表现或引发患者就诊的临床原因〔1〕。研究发现，恶性浆液性胸腔积液患者的疾病发病率明显增加〔2〕。先前的基础和临床应用研究表明，血管内皮生长抑制剂包括重组人内皮抑素(Rh-Endo)和贝伐单抗，显著抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖、抑制肿瘤血管、新生血管的生成〔2～5〕。研究报道，静脉使用内皮抑素治疗恶性肿瘤时，合并胸腹腔积液的效果优于原发或转移灶的效果，局部注射内皮抑素也实现了令人满意的局部控制〔6～8〕。因此，抗血管生成抑制剂可能是诊断和治疗恶性浆液性腹腔积液的重要方法。本研究旨在进一步观察Rh-Endo对恶性浆膜血管的调节作用，探讨其对恶性浆液性腹腔积液的作用机制，并对其治疗进行评价。

1 材料与方法

1.1主要仪器 超净工作台(Forma1205型，美国)；细胞培养箱(Forma-Sicentific，美国)；普通离心机(上海，飞鸽)；高速低温离心机(Heraeus 4008型，德国，Beckman)；超低温冰箱(MDF-U3 82型，日本，三洋公司)；普通冰箱(BCD-21 SYD，中国，海尔公司)；电子天平(FAZ004N型，上海精密科学仪器公司)；电子秤(DS-671型，上海寺冈电子公司)；酶标仪(ELx800,Blo-TEK型，美国)；光学显微镜(DM4000B型，德国Leica公司)；计算机图像分析系统(美国惠普)荧光定量PCR仪(ABI7500型，美国)；凝胶成像系统(Molecular Imager ChemiDoc XRS+，美国，BIO-RAD)。

1.2药品与主要试剂 Rh-Endo注射液(15 mg/支，江苏先声药业有限公司生产，批号：20180918)；RPMI1640培养基、冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)及胎牛血清(FCS)均购自美国Gibco公司；PCR试剂盒购自Invitrogen公司；基质金属蛋白酶(MMP)-2、血管内皮生长因子(VEGF)和生存素(Survivin)一抗及二抗均购自美国Abcam公司。

1.3细胞与实验动物 H22肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞生物学研究所，由本实验室保存并传代。BALB/C小鼠购于包头医学院实验动物中心，在SPF级环境下饲养，4～6周龄，体重18～25 g，雌雄各半。

1.4建立小鼠H22腹水瘤模型 将H22肝癌细胞系解冻并复苏，并将制备的RPMI1640培养基在5%CO2培养箱中于37℃培养。当肿瘤细胞生长至对数生长期时，用RPMI1640将细胞稀释成单细胞悬浮液，0.4%台盼蓝染色计数，活细胞数95%。抽取细胞悬液分别对2只小鼠进行腹腔内注射，每只注射量约0.2 ml(2.0×106/只)，约7 d将小鼠放到无菌操作台上，注射器抽取小鼠腹水，离心后用 RPMI1640进行稀释，将细胞浓度调整至1.0×107/ml。将20只小鼠以0.2 ml的剂量注射到腹膜腔中。

1.5试验分组和给药方法 使用内皮抑素10 mg/ml作为干预条件，依据不同给药方式将实验小鼠分为连续组(连续每日给药)，隔日组(每隔1 d给药)，隔2 d组(每隔2 d给药)和每周组(每周给药1次)，每组10只。腹水瘤模型构建成功后，从接种H22细胞第8天开始按照分组方法对小鼠注射内皮抑素，每次注药量均为0.2 ml/只。

1.6小鼠腹水及腹膜标本的获取 通过颈椎脱臼法处死小鼠。解剖小鼠的腹腔，暴露手术区域，沿腹部收集左右侧壁的腹膜组织(根据腹部中线的两侧，避开穿刺部位)。取出样品后，将其切成1.0 cm×0.5 cm的小片，并用盐水冲洗2次。清理干净血迹，10%甲醛液固定，冰箱保存。

1.7RT-PCR 使用RNA提取试剂盒提取RNA并测定RNA浓度，建立20 μl逆转录反应体系。MMP-2上游引物：5′-CAGAGGCAGTAGAGTAAGGG-3′，下游引物：5′-GGCAGCCATAGAAAGTGT-3′;VEGF上游引物：5′-TCACCAAAGCCAGCACAT-3′，下游引物：5′-ATGATGGCGTGGTGGTGA-3′;Survivin上游引物：5′-AACTACCGCATCGCCACCTT,下游引物：5′-TCCTGCTTCCCAATCAAC-3′;GADPH上游引物：5′-AGGAGCGAGACCCCACTAACAT-3′，下游引物：5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′。RT-PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5 μl、25 mmol/L MgCl21.5 μl、1.0 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μl Taq酶0.5 μl、1 mmol/L上下游引物各1 μl，再加双蒸水补足反应总体积为20 μl。反应条件为：95℃热启动5 min，95℃变性20 s，55℃退火延伸40 s，40个循环后，在55℃时采集荧光信号。

1.8Western印迹 (1)蛋白提取：按常规方法提取小鼠腹膜组织中的蛋白并测定含量，制备电泳上样蛋白样品及电泳凝胶。(2)电泳、转膜、封闭：先用80 V跑浓缩胶，marker完全分离后改为120 V跑分离胶，观察蛋白条带位置满意后停止电泳；切取合适大小的含目标蛋白及内参蛋白的凝胶，采用湿转法进行转膜，90 V转膜1.5 h；取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用1.5%脱脂牛奶在室温下封闭1.5 h。(3)孵育：按说明书进行抗体孵育，其中一抗(1∶1 000)在4℃孵育过夜，二抗(1∶1 000)在室温下封闭1 h。(4)曝光：二抗孵育后，用PBS充分洗涤，在暗室中反应40～60 s，采用全自动化学发光凝胶成像系统曝光并保留图片。LANE1D图像分析软件分析处理。观察第7、9、10、13、13天(d7、d9、d10、d11、d13)小鼠腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin蛋白的表达情况。

1.9统计学分析 应用SPSS19.0软件进行配对t检验、ANOVA方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1腹膜组织PCR检测结果 PCR结果显示，用药后MMP-2 mRNA、VEGF mRNA及Survivin mRNA的相对表达量显著下降(P<0.001)，且随着给药次数增多，其表达量均呈下降趋势。其中，隔2日给药组在d13的表达量均显著低于其他各组，差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 各组MMP-2、VEGF、Survivin mRNA的相对表达量比较

续表1 各组MMP-2、VEGF、Survivin mRNA的相对表达量比较

2.2连续给药腹膜组织中蛋白质表达比较 随时间延长，连续组MMP-2、VEGF和Survivin水平明显减低，组间差异有统计学意义(P<0.001)；隔日组与隔2日组差异无统计学意义(P>0.05)，但明显优于每周给药组(P<0.001)。见图1，表2。

图1 Western印迹检测腹膜组织中蛋白表达

表2 不同间隔给药后腹膜组织VEGF、Survivin、MMP-2蛋白表达

续表2 不同间隔给药后腹膜组织VEGF、Survivin、MMP-2蛋白表达

3 讨 论

晚期恶性肿瘤许多并发症严重影响患者的生活质量，包括腹水、胸腔积液和心包积液。积液的产生受到多种因素的影响，包括原发肿瘤部位、转移部位、产生速度、产生途径和治疗效应等因素，积液的产生作为恶性肿瘤的急症，甚至可以直接危及生命〔9～11〕。目前临床上多应用恶性浆膜腔穿刺，腔内减压引流、腔内药物灌注进行治疗，即便如此，其整体治疗疗效常不满意。

在恶性浆液性胸腔积液的机制研究中〔6〕，积液的产生主要与膜的结构有关。淋巴管阻塞、淋巴循环障碍导致的局部循环与血液循环水、电解质、蛋白质之间的失平衡是引发液体潴留的主要因素〔12〕。有研究〔13〕发现内皮抑素可显著下调VEGF受体水平并抑制肿瘤淋巴管生成的形成，证实，内皮抑素、生物因子、膜结构等是恶性浆液性胸腔积液形成的机制之一。这些可能与多种生物活性多肽有关，包括VEGF、bFGF、MMPs等〔10～12〕。VEGF促进血管生成并增加血管通透性。阻断血管、淋巴或液体操作障碍方面具有强大的作用，肿瘤效应和相关性的炎症反应性因子、VEGF和 MMPs等生物学因子〔14〕、新生的肿瘤血管毛细血管网面积增大，诸多因素均具有相互作用、单独作用及协同效应〔15〕。内皮细胞的抑制作用、增殖活性的下降、诱导细胞凋亡、促进MMPs水平产生均是治疗阻断血管生成的主要途径，具有广泛的抗癌活性。

内皮抑素具有多种抗肿瘤机制，可诱导细胞凋亡、抑制血管生成，抑制肿瘤侵袭转移，直接影响细胞间的链接-联接结构，可以阻止细胞黏附并干扰肿瘤细胞的侵袭〔16〕。内皮抑素在基础研究和临床应用中也具有相似的作用，并能很好地抑制恶性浆液性胸腔积液的形成，影响腹膜微血管通透性的因素可减少恶性浆液性渗出物的产生〔17〕。本研究结果表明，内皮抑素对腹膜组织中VEGF、MMP-2和Survivin具有抑制作用。同时提示膜血管微环境是影响该药物作用的主要内容，膜血管微环境的改变也是治疗相关的主要因素和药物干预因素〔6〕。

适宜的选择、合适的药物剂量和治疗药物给予时间可使疗效最大化，在药物治疗经济学也有益处。对于部分将可以采用特殊治疗途径给药的患者而言，特殊的治疗方式可能会获得更有价值的治疗疗效和治疗优势。腔内注射内皮抑素可显著降低腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin mRNA和蛋白表达水平。内皮抑素的给药对恶性浆液性胸腔积液具有多因素作用，不同的用药模式具有一定的效应差异。