王丽辉 金鄂 唐屹 罗京霞 郑萍 曾真

(荆门市第一人民医院心功能室，湖北 荆门 448000)

人类基因组中有超过80%的基因被转录，但只有不到2%的基因最终编码蛋白质，这意味着大部分DNA序列被转录为非蛋白编码的RNA。这些非编码RNA中短链非编码RNA如microRNAs，在潜在的疾病标志物及治疗靶点等方面已经进行过深入的研究〔1〕。近年来发现了一种新型的非编码RNA，其长度超过200个核苷酸，被称为长链非编码RNA(lncRNA)，并不具有编码蛋白的能力，但近期研究表明，lncRNA能以RNA的形式在多种层面上(表观遗传、转录及转录后水平)调控基因的表达，参与了剂量补偿效应、基因组印迹、细胞发育分化等重要生物学过程〔2〕。虽然对lncRNAs功能和作用机制的研究尚处于起步阶段，但已有不少证据表明lncRNA在肿瘤、免疫、神经系统疾病、心血管疾病的发生发展中起重要作用，是当前心血管疾病研究热点之一〔3〕。研究表明，lncRNA参与调节心脏的发育〔4〕。心肌梗死相关转录体(MIAT)位于染色体22q12.1上的心肌梗死易感位点，具有5个外显子，且体外实验表明MIAT不编码任何蛋白质，属于一种lncRNA。研究发现MIAT转录区内多个单核苷酸多态性(SNPs)与心肌梗死易感性相关〔5，6〕，可能在转录后水平(剪接)调节基因表达〔7〕。缺氧诱导因子(HIF)是一种天然的HIF1α反义转录本，在心力衰竭患者中表达升高〔8〕，通过调节HIF1α的mRNA来调控新生血管生成，这对心肌缺血而言是一种重要的反馈。由此猜想lncRNAs可能作为急性冠脉综合征(ACS)新的生物学标志物和治疗靶点。本研究拟探讨ACS患者外周血单个核细胞aHIF及MIAT的表达水平及其对ACS的诊断价值。

1 材料及方法

1.1研究对象 经医院伦理委员会批准及患者知情同意，收集荆门市第一人民医院心内科住院部2016年9月至2017年2月确诊的ACS患者91例，其中急性心肌梗死(AMI)42例，不稳定型心绞痛(UA)49例，同时选取同时间段冠脉造影狭窄程度<50%的住院患者49例为对照组。所有患者行冠脉造影，根据病史、检查结果、冠脉造影及手术报告并在2名经验丰富的冠脉介入医师协助下进行分组。ACS诊断参照2014年美国心脏病学会(ACC)和美国心脏协会(AHA)发布的心血管诊疗指南标准。排除急性感染、肿瘤、脑卒中、血液系统疾病、严重肝、肾功能异常等患者。

1.2试剂 TRIzol®Reagent购自美国invitrogen公司；反转录(RT)试剂盒和荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自日本TOYOBO公司；引物由上海生物工程有限公司合成；Epoch酶标仪购自美国BioTek公司；普通PCR仪购自美国Bio-Rad公司；LightCycler®480‖荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。人外周血淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司。

1.3标本采集 所有患者在进行冠脉造影前通过动脉导管收集外周血3 ml至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。ACS患者采血时间均在胸痛发作后(5.2±1.1)h内。

1.4实时荧光定量反转录(qRT)-PCR测定外周血细胞中lncRNA aHIF和MIAT水平 利用人外周血淋巴细胞分离液从人抗凝血中分离出单个核细胞，实验步骤严格按照人外周血淋巴细胞分离液说明书操作。采用TRIzol®Reagent试剂从外周血单个核细胞中提取总RNA。Epoch酶标仪检测RNA溶液D260/D280比值，计算RNA浓度及纯度，取D260/D280比值在1.8～2.0者用于反转录。取500 ng RNA进行反转录成cDNA，按照反转录试剂盒说明书配10 μl反应体系，反应条件为42℃ 15 min，98℃ 5 min，转录得到cDNA用于qRT-PCR反应。以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，35个循环。lncRNA-aHIF和MIAT的相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。引物序列见表1。

表1 引物序列号

1.5统计学分析 采用SPSS18.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析、秩和检验、Pearson相关性分析、受试者工作特征(ROC)曲线分析。

2 结 果

2.1一般资料 对照组与ACS组的年龄、性别、吸烟史、糖尿病史、高血压史比较无明显差异(P>0.05)，说明两组受试者的基础水平基本一致。ACS组肌钙蛋白(cTn)I、肌酸肌酶(CK)、肌酸肌酶MB同工酶(CK-MB)水平显著高于对照组，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显低于对照组(P<0.05)。AMI亚组与UA亚组的收缩压、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、cTnI、CK、CK-MB水平均有统计学差异(P<0.05)，糖化血红蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、舒张压比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组受试者临床资料比较

2.2各组受试者外周血单个核细胞中aHIF和MIAT的相对表达量 ACS组外周血细胞aHIF及MIAT表达水平显著高于对照组(P<0.05)，AMI亚组外周血细胞aHIF表达水平显著高于对照组和UA亚组(P<0.05)。UA亚组外周血细胞MAIT表达水平显著高于对照组和AMI亚组(P<0.05)，见表3。

表3 各组受试者外周血单个核细胞中aHIF和MIAT的相对表达量

2.3AMI亚组外周血细胞aHIF及MIAT水平与CK、CK-MB、cTnI水平的相关性 AMI亚组外周血细胞aHIF、MIAT水平与cTnI、CK-MB无相关性(P>0.05)；aHIF与CK呈弱正相关(r=0.317，P<0.05)，与MIAT无相关性(P>0.05)。

2.4外周单个核细胞aHIF、MIAT对ACS和AMI诊断的ROC曲线 aHIF对ACS及AMI诊断的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.791(95%CI：0.741～0.840，P<0.01)、0.838(95%CI：0.780～0.895，P<0.01)。以aHIF的约登指数对应的最大切点0.422为最佳临界点，aHIF对ACS的诊断临界值为0.002 144 829(2-ΔΔCt值)，其敏感度为60.2%，特异度为82.0%。以aHIF的约登指数对应的最大切点0.589为最佳临界点，aHIF对AMI的诊断临界值为0.002 282 892(2-ΔΔCt值)，其敏感度为59.0%，特异度为98.0%。见图1、2。MIAT对ACS及AMI诊断的ROC曲线分析AUC均小于0.5，不考虑其对诊断有意义。

图1 aHIF诊断ACS的ROC曲线

图2 aHIF诊断AMI的ROC曲线

3 讨 论

ACS是冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)中比较严重的类型，发现并利用冠心病相关的生物标志物更快速、准确、早期识别冠心病高危人群与诊断ACS一直是当今的研究热点。对冠心病乃至ACS的诊断、病情评估、危险分层、预后判断等方面的生物标志物的研究已比较成熟，对冠心病的诊断治疗及管理发挥了重要总用。但须认识到，单一的标志物一般只反映疾病发生的某个环节，检测具有局限性，因此国内外不少学者专家推荐多种生物标志物联合诊断冠心病，从多方面评估病情，为疾病治疗提供有效靶点〔9〕。

近年来lncRNAs逐渐成为研究热点，研究表明，lncRNAs不但在生理性心脏发育、心脏各类型细胞分化和转化过程中发挥重要作用，而且在心脏疾病，如心肌肥厚、心力衰竭、心肌梗死和心脏缺血再灌注损伤等病理性疾病发生发展中也起关键作用〔10〕。在冠心病方面，aHIF可以通过调节HIF1α信使RNA的稳定性来调节微血管生成，这对心脏缺血时非常重要。一项纳入414例行经皮冠脉介入术开通犯罪血管的AMI患者的研究发现，在发生AMI后，外周血细胞lncRNA的表达水平受到严格调控，且与左心室功能不全程度、心肌损伤标志物、心血管疾病危险因素相关；与健康受试者相比，心肌梗死患者外周血细胞aHIF表达升高〔11〕。本研究提示，aHIF可能对AMI的早期诊断有一定帮助。

Ishii等〔12〕使用52 608个基于单倍体的单核苷酸多态性标志物进行大规模病例对照关联研究，发现位于染色体22q12.1上的心肌梗死易感位点，在此位点上分离出MIAT，且体外实验表明MIAT不编码任何转录产物，是一种功能性RNA，同时通过全基因组关联研究发现lncRNA MIAT转录区多个SNPs与心肌梗死易感性相关。MIAT主要存在于特殊的核小体中，与剪接因子类固醇生成因子有高度亲和力，可能在转录后水平(剪接)调节基因表达〔7〕。对成年雄性小鼠行冠状动脉结扎术制造AMI模型，对其进行微阵列分析显示MIAT1和MIAT2升高最显著，分别为5倍和13倍，进一步分析发现这两种lncRNA在心肌梗死后24 h达到高峰，且2 d后恢复至基线水平〔6〕。本实验与Vausort等〔11〕报道结果一致，考虑可能为升高机制及升高时间等方面的差异，有待进一步研究证实。

已经证明衡量外周血细胞中lncRNA水平对冠状动脉疾病高危患者有预测价值〔13〕。本研究中仅CK与aHIF有较弱相关性，考虑原因可能为：(1)两者存在位置不同，升高机制不一样；(2)时间关系，导致外周血细胞中aHIF和MIAT与外周CK、CK-MB、cTnI外周血升高不同步。综上，本次临床研究证实了aHIF和MIAT在ACS患者外周血细胞中表达水平发生改变，其中aHIF表达水平升高，有望作为ACS诊断的潜在标志物及治疗靶点。