李华峰 张广凤 赵文杰 李敏 田霖林 鞠文文

(齐齐哈尔医学院附属第三医院内分泌科，黑龙江 齐齐哈尔 161002)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症，若早期治疗不及时，可导致肾脏功能严重损伤而威胁患者生命。DN的发病机制十分复杂，相关研究表明，氧化应激及高血糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡在DN发病及进展中都起到重要作用〔1～3〕。microRNA(miR)是一类小分子非编码RNA，近年来对DN患者血清、尿液中miR表达水平的研究表明，miR异常表达与DN病理生理过程密切相关，且证实利用miR干扰靶基因转录后翻译的特性，对DN起到治疗改善作用〔4～6〕。Federica等〔7〕报道，miR-424在早期DN患者尿液外泌体中表达下调，可能参与DN病理过程。胰岛素样生长因子(IGF)-1是一类多功能细胞调控因子，有研究报道，高糖培养可增加人肾小球细胞中IGF-1释放，诱导IGF-1受体(IGF1R)表达上调而加重肾小球损伤〔8〕。此外，IGF1R拮抗剂可通过抑制肾小管上皮间质转化改善DN大鼠肾纤维化，提示抑制IGF1R具有改善肾损伤的作用〔9〕。目前，miR-424和IGF1R对高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡和氧化应激的影响未见报道。本研究以大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1为研究对象，探讨miR-424和IGF1R在高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡和氧化应激中的潜在作用。

1 材料与方法

1.1细胞系 大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1购自上海富衡生物科技有限公司。

1.2主要试剂 胎牛血清和DMEM培养基购自Gibco公司；miR阴性对照、miR-424-mimics、小干扰RNA阴性对照、siRNA-IGF1R、pcDNA3.1空载体、pcDNA3、1-IGF1R均于广州辉骏生物科技有限公司合成；实验用一抗和二抗购自上海艾博抗贸易有限公司；丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA比色法)，超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(NBT核黄素比色法)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(微量酶标法)购自碧云天生物技术研究所；实验用其他生化试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养、分组 预先配制含10%胎牛血清的DMEM培养液。将冷冻的HBZY-1细胞迅速放入37℃水浴锅中解冻，1 000 r/min离心1 min，弃上清，加入1 ml培养液重悬，取适量细胞悬液加入盛有5 ml培养液的培养瓶中，放于37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至90%左右融合时，加入0.25%胰蛋白酶消化进行传代培养。

将对数生长期的细胞随机分组：正常糖浓度组(NG组，培养液中糖浓度5.5 mmol/L)、高糖组(HG组，培养液中糖浓度25.0 mmol/L)、高糖+转染组〔细胞转染miR阴性对照(miR-con)、miR-424-mimics(miR-424)、小干扰RNA阴性对照(si-con)、siRNA-IGF1R(si-IGF1R)、pcDNA3.1空载体、pcDNA3.1-IGF1R(pcDNA-IGF1R)后，在糖浓度25.0 mmol/L的培养液中培养〕。各组细胞培养48 h后收集细胞和上清液进行后续实验。

1.3.2实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)实验 用TRIzol试剂抽提细胞RNA，紫外分光光度计下检测RNA样品纯度，2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品完整性。使用Takara逆转录酶合成cDNA，以cDNA为模板采用SYBR Green染料法进行qPCR反应。结果采用2-△△Ct法，以U6为内参基因计算miR-424相对表达水平，以β-actin为内参基因计算IGF1R mRNA相对表达水平。

1.3.3Western印迹实验 用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法检测蛋白浓度，取50 μg蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离的目的蛋白转移至PVDF膜，并用5%脱脂奶粉呢封膜2 h。TBST溶液洗膜，加入IGF1R抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体和β-actin抗体一抗4℃ 孵育过夜，TBST溶液洗膜后加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育2 h。洗膜后加入ECL发光液中显色。凝胶成像系统下曝光、拍照，应用Image-Pro Plus软件分析蛋白灰度值，计算目的蛋白相对表达水平。

1.3.4细胞上清液中氧化应激指标检测 采用比色法检测细胞上清液中MDA和SOD含量，采用酶标法检测上清液中LDH活性，实验操作方法严格参照试剂盒说明书进行。

1.3.5双染法流式细胞术 重悬细胞，调整细胞密度为5×106个/ml并转移至无菌离心管，离心，弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤细胞2次。用1倍结合缓冲液重悬细胞，然后分别加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)各5 μl混匀，避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.6双荧光素酶报告基因实验 收集对数生长期的HBZY-1细胞，将IGF1R-3′UTR野生型(WT)质粒和IGF1R-3′UTR突变型(MUT)质粒，分别与miR-con、miR-424-mimics共转染细胞，常规培养48 h后，加入裂解液裂解，4℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清液检测荧光素酶活性。

1.4统计学分析 应用SPSS19.0统计学软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1miR-424和IGF1R在高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞中的表达 与NG组比较，HG组大鼠肾小球系膜细胞中miR-424表达明显下调(P<0.05)，IGF1R mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图1和表1。

图1 肾小球系膜细胞IGF1R蛋白表达

表1 肾小球系膜细胞中miR-424和IGF1R的表达

2.2上调miR-424抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡 与NG组比较，HG组大鼠肾小球系膜细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，细胞中Bax蛋白表达明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)；与HG+miR-con组比较，HG+miR-424组肾小球系膜细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，细胞中Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。见表2和图2、图3。

图3 Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡率

表2 miR-424过表达对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

2.3上调miR-424抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激损伤 与NG组比较，HG组肾小球系膜细胞中LDH、MDA活性明显增强(P<0.05)，SOD活性明显降低(P<0.05)；与HG+miR-con组比较，HG+miR-424组肾小球系膜细胞中LDH、MDA活性明显降低(P<0.05)，SOD活性明显增强(P<0.05)。见表3。

表3 miR-424过表达对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞氧化应激损伤的影响

2.4miR-424靶向调控IGF1R的表达 生物信息学软件TargetScan分析结果miR-424能够与IGF1R的3′UTR区靶向结合(图4A)。双荧光素酶报告基因实验结果(表4)，过表达miR-424明显抑制肾小球系膜细胞中IGF1R转录活性，而将IGF1R的3′UTR区突变后抑制作用消失。Western印迹结果表明(图4B)，与miR-con组(0.31±0.04)比较，miR-424细胞中IGF1R蛋白表达明显减少(0.09±0.03，P<0.05)；与anti-miR-con组(0.27±0.03)比较，anti-miR-424组细胞中IGF1R蛋白表达明显减少增多(0.69±0.08，P<0.05)。

表4 双荧光素酶报告实验

图4 miR-424靶向调控IGF1R的表达

2.5沉默IGF1R抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡和细胞氧化应激损伤 与HG+si-con组比较，HG+si-IGF1R组肾小球系膜细胞中IGF1R蛋白和Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)，细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，细胞中LDH和MDA活性明显降低(P<0.05)，SOD活性明显增强(P<0.05)。见表5和图5。

表5 沉默IGF1R对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡和氧化应激损伤的影响

图5 肾小球系膜细胞中IGF1R、Bax、Bcl-2蛋白表达

2.6过表达IGF1R逆转上调miR-424对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的保护作用 与HG+miR-424+pcDNA组比较，HG+miR-424+pcDNA-IGF1R组肾小球系膜细胞中IGF1R蛋白和Bax蛋白表达明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)，细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，细胞中LDH和MDA活性明显增强(P<0.05)，SOD活性明显降低(P<0.05)。见表6和图6。

表6 过表达IGF1R和上调miR-424对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的影响

图6 肾小球系膜细胞中IGF1R、Bax及Bcl-2蛋白表达

3 讨 论

系膜细胞作为肾小球固有细胞中最为活跃的细胞，其凋亡异常改变在肾小球损伤过程中起关键作用，对慢性肾脏疾病具有重要研究意义〔10，11〕。Bcl-2蛋白家族是调控细胞凋亡的关键蛋白因子，其中Bax是Bcl-2家族中最具有代表性的促凋亡蛋白，而Bcl-2是Bcl-2家族中最具有代表性的抗凋亡蛋白〔12〕。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，当Bax异常高表达时，细胞凋亡率增加，Bax低表达或不表达时细胞凋亡率降低，而Bcl-2则相反〔13〕。本研究结果说明高糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡增加。

正常生理状态下，机体可产生少量活性氧参与正常代谢；而高糖可诱导肾组织细胞内活性氧大量产生，使脂质过氧化产物MDA过量产生，超过肾脏内源性抗氧化物对其清除能力，从而导致肾脏发生氧化应激损伤〔14，15〕。LDH异常增高与组织器官受损程度呈正比，与MDA一起是氧化应激损伤的标志物〔16〕。本研究说明细胞受到氧化应激损伤。miR-424是一种重要的miRNA，Wang等〔17〕报道，miR-424在DN大鼠肾组织中表达显著下调，而干扰miR-424可有效改善大鼠肾脏病变程度和症状。本研究结果说明过表达miR-424对高糖诱导的系膜细胞损伤有保护作用。

IGF是影响肾脏细胞病理生理功能的重要因子。陈海燕等〔18〕报道，DN患者血清IGF-1水平显著升高，与2型DN发生发展显著相关。IGF1R是IGF-1的特异性受体，本研究结果，IGF-1能够促进肾小球系膜细胞增生和系膜外基质发生扩张，导致肾小球硬化，还可增加肾小球系膜细胞对葡萄糖的摄取，其促进DN发生及发展的作用依赖于肾脏细胞中特异性受体IGF1R的存在〔19，20〕。因此抑制IGF1R表达可阻断IGF-1对肾小球的损伤，减轻高糖刺激的肾脏损伤。

本研究通过生物信息学软件分析发现，IGF1R可能是miR-424的靶基因。相关实验证实在大鼠肾小球系膜细胞中miR-424可靶向负调控IGF1R的表达，进一步分析发现，与单独过表达miR-424的细胞相比，同时过表达miR-424和IGF1R的细胞在高糖诱导下细胞凋亡率增加，氧化应激水平升高，推测miR-424通过靶向IGF1R发挥对高糖诱导的系膜细胞凋亡和氧化应激的改善作用，保护肾脏组织。

综上，高糖条件下，大鼠肾小球系膜细胞中miR-424表达降低，IGF1R表达升高，与高糖诱导的系膜细胞凋亡和氧化应激水平有关。干扰miR-424可能通过靶向IGF1R降低高糖诱导的系膜细胞凋亡和氧化应激，降低肾脏细胞损伤程度，为miR-424在DN靶向治疗中的应用提供了实验基础。