莫安薇 黄琰菁 杨生辉 王燕艳

(海南省人民医院肿瘤内科二区，海南 海口 570311)

克罗恩病(CD)是炎症性肠病(IBD)的一种，该病以慢性复发性肠道炎症为主要临床表现〔1〕。CD患者的病理学改变主要为透壁性肠炎，而这种炎症的典型特点是过度激活的Th1及Th17型免疫反应，相反Treg水平显著低下〔2〕。此外，肠屏障功能受损也是CD的主要发病机制假说之一。因此，针对肠黏膜免疫反应和屏障保护的治疗有望延缓CD疾病进程。槐果碱(Sophocarpine)是从中药苦豆子植物中提取的一种生物碱，新近的研究显示其具有抗炎、抗氧化及免疫调节作用〔3,4〕。本文观察Sophocarpine对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎小鼠的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 采用6～8周龄，雄性Balb/c小鼠(购于南京大学模式动物研究所)，体重为(22.0±1.5)g，SPF环境饲养，控制环境温度为(23±2)℃，普通饲料喂养，自由饮水。

1.2主要试剂 Sophocarpine(货号：SML2422)、TNBS(货号：P2297)、异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖(货号：46944)购于美国Sigma公司。兔抗鼠胱冬肽酶(Caspase)-1抗体(货号：ab179515)、兔抗鼠凋亡相关斑点样蛋白(ASC)抗体(货号：ab238848)、兔抗鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3(货号：ab232401)、兔抗鼠ZO-1抗体(货号：ab96587)及兔抗鼠claudin-1抗体(货号：ab15098)均购于英国Abcam公司。白细胞介素(IL)-10(货号：PM1000B)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(货号：PMTA00B)及干扰素(IFN)-γ(货号：PMIF00)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于美国R&D公司。

1.3结肠炎模型建立及分组干预 Balb/c小鼠接受TNBS造模，采用0.7%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经肛门灌入0.1 ml TNBS 50%乙醇溶液(TNBS剂量为150 mg/kg)，保持小鼠头低脚高倾斜30°体位30 min，7 d后小鼠形成稳定的肠炎〔5〕。造模后随机分为模型组及干预组，每组8只。干预组每日接受Sophocarpine腹腔注射(50 mg/kg，溶于0.1 ml生理盐水)，模型组接受等量生理盐水。干预4 w后处死小鼠进行后续检测。

1.4结肠组织学炎症评分 取小鼠结肠常规进行石蜡包埋，HE染色，参照Spencer等〔6〕报道进行炎症评分，评分范围0～4分，分数高提示炎症严重。

1.5结肠黏膜炎症介质水平评估 刮取小鼠结肠黏膜组织，采用ELISA试剂盒，依据说明检测TNF-α、IFN-γ及IL-10水平。

1.6肠通透性评估 依据既往报道〔7〕，禁食4 h后，灌胃法给予每只小鼠FITC-葡聚糖600 mg/kg；灌胃后4 h处死，眼球取血0.5 ml，静置后分离提取血清，采用荧光测定法检测FITC-葡聚糖水平。

1.7脾及肠系膜淋巴结Treg细胞检测 取小鼠肠系膜淋巴结及脾脏，匀浆，用流式细胞检测法检测Treg(Foxp3+CD25+CD4+)细胞比例，采用FlowJo-V10软件分析Treg细胞在脾和淋巴结中的比例。

1.8Western印迹法检测小鼠结肠内蛋白 刮取肠黏膜组织，充分匀浆，提取总蛋白，Bradford法定量，电泳、转膜、封闭，加入Caspase-1、ASC、NLRP3、ZO-1、claudin-1或β-actin一抗稀释液(1∶1 000)，4℃摇床12 h，滴加二抗，洗膜，显影并拍照，结果采用Image J软件分析。

1.9统计学方法 采用GraphPad8.0软件进行非配对t检验。

2 结 果

2.1Sophocarpine改善了结肠炎小鼠结肠组织学炎症评分 模型组结肠组织炎症评分〔(3.10±0.74)分〕显著高于干预组〔(2.10±0.74)分，P<0.01〕。见图1。

图1 两组结肠组织炎症(HE，×100)

2.2Sophocarpine抑制了结肠炎小鼠肠黏膜炎症介质水平 干预组结肠黏膜炎症介质IFN-γ〔(18.56±3.98)pg/mg〕及TNF-α水平〔(23.65±5.10)pg/ml〕显著低于模型组〔(32.69±5.90)pg/ml、(39.53±6.92)pg/ml〕，而IL-10水平〔(31.53±4.87)pg/mg〕显著高于模型组〔(23.65±5.19)pg/mg，P<0.01〕。

2.3Sophocarpine促进了结肠炎小鼠脾及肠系膜淋巴结Treg细胞比例 干预组脾及肠系膜淋巴结Treg细胞比例(7.53%±1.89%、8.95%±1.96%)均显著高于模型组(4.23%±0.79%、5.19%±1.24%，P<0.01)。两组1例样本流式分析。见图2。

图2 两组各1例样本Treg细胞比例

2.4Sophocarpine干预改善了结肠炎小鼠肠屏障功能 干预组肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1(1.89±0.26)及claudin-1水平(2.16±0.31)均显著高于模型组(1.00±0.18、1.00±0.16，P<0.01〕；肠屏障通透性实验显示，干预组血清FITC-葡聚糖浓度〔(369.51±89.69)ng/ml〕显著低于模型组〔(852.96±125.30)ng/ml，P<0.01〕。见图3。

图3 两组肠屏障功能检测

2.5Sophocarpine干预抑制了结肠炎小鼠结肠NLRP3炎性小体信号 干预组肠黏膜NLRP3(1.00±0.13)、ASC(1.00±0.12)及Caspase-1水平(1.00±0.14)均显著低于模型组(1.68±0.21、2.16±0.36、2.35±0.38，P<0.01)。见图4。

图4 两组肠黏膜NLRP3炎性小体

3 讨 论

既往IBD属于较为罕见的疾病，而近年来其发病率的迅速攀升已成为消化系统领域的一个棘手问题。我国的IBD诊疗水平尚处于起步与发展阶段，仍然面临诸多问题。导致IBD临床治疗效果不佳的最终因素是发病机制不明确，这使得拮抗结肠炎症成为治疗的关键点〔8〕。当前的治疗药物多以免疫抑制为主，虽然具有一定疗效但却有较多的毒副作用〔9〕。青蒿素在疟疾治疗中取得的巨大成功，启发学术界从植物提取物中发掘有效的免疫调节剂用于治疗IBD。Sophocarpine是一种生物碱，来源于天然植物，具有较高的生物安全性〔3〕。既往研究显示Sophocarpine可以通过下调核转录因子(NF)-κB信号通路从而改善小鼠关节炎〔10〕。也有研究显示Sophocarpine可以通过抑制NLRP3炎症小体而改善系统性红斑狼疮小鼠的肾炎〔10〕。事实上，CD和类风湿关节炎、系统性红斑狼疮具有相似的免疫病理学改变，这些疾病的炎症反应均主要表现为Th1型免疫反应亢进，而Treg细胞比例下降〔11〕。

IFN-γ及TNF-α是Th1、Th17细胞下游重要的促炎介质，在维持IBD肠道慢性炎症及引发炎症级联放大中发挥关键促进作用；而IL-10是机体为数不多的抗炎细胞因子，在平衡局部和系统性炎症反应中发挥重要调控作用〔12,13〕。本文结果提示Sophocarpine在体治疗具有调节肠道局部炎症反应的效果。Treg是一种免疫调节细胞，可抑制过度激活的免疫/炎症反应，在IBD的免疫病理过程中发挥保护性作用；且Treg还具有调节肠道局部Th1、Th17免疫细胞平衡的作用，这一定程度解释了Sophocarpine的抗炎作用途径〔14,15〕。肠屏障功能的破坏导致IBD患者肠黏膜免疫系统直接与肠道内抗原接触，从而引发或维持急慢性肠道炎症，这是经典的IBD发病机制假说之一〔16〕。本研究显示Sophocarpine治疗可显著改善结肠炎小鼠肠屏障结构和功能，这可能是其拮抗肠炎的另一重要途径〔17〕。NLRP3炎性小体在IBD患者肠道炎症反应中扮演重要促进角色，其下游调控IL-1β等多种促炎介质表达，且其抑制Treg细胞〔18,19〕。本文结果提示，Sophocarpine可显著抑制结肠炎小鼠结肠组织内NLRP3炎症小体的水平，这可能是其发挥保护肠道的作用机制之一。由此可见，Sophocarpine可通过影响肠道局部免疫细胞亚群平衡、抑制NLRP3及炎症介质水平发挥肠道炎症保护性作用，但更深入的作用机制仍待明确。