韩 莎, 赵 斌, 李成林, 胡 炜, 刘兆存

(1.山东省海洋生物研究院，山东 青岛 266104；2.山东黄河三角洲海洋科技有限公司，山东 东营 257000)

稳定的养殖水体环境是水生生物赖以生存的关键，水生生物病害及死亡的发生通常最先由环境因子的变化所诱导，从而引起养殖生物的应激反应使其免疫能力下降[1-2].水生生物对不同的水质因子，如温度[3]、盐度[4]和氨氮[5]等有不同的适应性，在众多的水质理化因子中，pH是能够反映水质状况的综合性指标，但易受多种因素影响而引起其波动或剧烈变化，对水质和水生生物有多方面的影响[6].不同水生生物对pH的适应性不同，同一物种不同规格及不同地理群体的pH耐受性也存在差异.目前，国内外学者已开展大量关于pH急性胁迫对水生生物影响的研究，如虾类[7-9]、蟹类[1]、贝类[2,10]和鱼类[11]等.

近年来，刺参(ApostichopusjaponicusSelenka)的消费需求日益扩大，养殖产业发展速度和生产规模均达到了前所未有的水平，成为我国海水养殖的主导产业之一[12-13].刺参养殖方式多样化，陆基池塘养殖是刺参养殖的主要模式.近年来，由于异常气候以及养殖环境的变化，致使池塘养殖的刺参因水质因子过度变化引起的综合并发症逐年上升，对我国刺参陆基养殖以及浅海增殖的产量均造成了严重影响，年损失高达数十亿元以上，诱发的次生灾害更使养殖产业一度呈现负增长[14].通常情况下，pH很少单独对水生生物产生直接毒害，pH能够与其他环境因子协同作用，对水生生物产生影响.pH作为水质关键因子对刺参生长、生理及免疫机能的影响正逐渐成为众多学者关注的问题之一，目前已有一些关于pH胁迫条件下对刺参存活、生长、消化和免疫影响的报道[15-16]，但针对pH急性胁迫对刺参免疫调节功能的影响尚未见报道.本试验研究pH突变和时间效应对刺参非特异性免疫酶活性的影响，从免疫学角度探讨刺参应对pH胁迫的反应机制，旨在为刺参池塘健康养殖、病害防控及其对环境适应性的研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

供试刺参为青岛国家海洋科研中心山东省海洋生物研究院鳌山基地选育的健康苗种.选取体表正常、活力强、摄食良好的刺参苗种暂养于0.2 m3的玻璃钢槽中，平均体重为(14.56±0.18) g.试验用海水为经沉淀沙滤的自然海水，盐度31.2，水温(15.8±0.3) ℃，pH 8.2，溶解氧含量≥6.5 mg·L-1，24 h连续充气.

1.2 试验设计

通过预试验摸索出刺参存活的pH范围，设置5个pH处理组，pH分别为7.3、7.5、8.2、8.9和9.1，每个试验组设3个平行.其中，低pH处理组的pH分别为7.3和7.5，对照组的pH为8.2，高pH处理组的pH分别为8.9和9.1.试验在80 cm×60 cm×48 cm的塑料水箱中进行，每箱随机投放20头刺参，试验期间停止喂食.用1 mol·L-1盐酸和1 mol·L-1氢氧化钠调节各试验组相应的pH浓度，每天采用多参数水质分析仪校正水体pH 3次，使其维持在试验水平，变化幅度为±0.05个单位.pH调节采取骤降的变化方式，各试验组直接将pH调节至设定的值并保持稳定后，开始胁迫试验.

1.3 样品的采集、处理及酶活性的测定

于pH胁迫后的3、6、12、24、48、72和96 h时采集样品，每次从每个平行组随机选取2头刺参，用一次性注射器抽取刺参体腔液，立即将其于1 000 r·min-1离心10 min(4 ℃条件下)，取上清液分装于灭菌离心管中，放置在冰箱(-80 ℃)中待测.样品的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)和溶菌酶(lysozyme, LZM)活性采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒测定，按照试剂盒说明书的步骤操作.

1.4 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示, 采用SPSS 18.0和Excel 2010软件进行统计学分析，P<0.05为显著差异.

2 结果与分析

2.1 pH急性胁迫对刺参SOD活性的影响

pH急性胁迫对刺参体腔液SOD活性的影响(图1)显示：与对照组相比，低pH处理组的SOD活性随着胁迫时间的增加呈现先上升后逐渐下降的趋势，6 h时达到最大值，pH为7.3、7.5的SOD活性分别为(102.78±1.95)和(98.78±1.86) U·mL-1，与对照组的差异显著(P<0.05)，随后SOD活性逐渐下降，48 h时下降至对照组水平(P>0.05)；高pH处理组的SOD活性总体也呈现先上升后下降的趋势，6 h时的SOD活性达到峰值，pH为8.9、9.1的SOD活性分别为(105.73±1.72)和(109.34±1.81) U·mL-1，与对照组的差异显著(P<0.05)，48 h时的SOD活性下降幅度较大，96 h时的SOD活性显著低于对照组(P<0.05).

2.2 pH急性胁迫对刺参CAT活性的影响

pH急性胁迫对刺参体腔液CAT活性的影响(图2)显示：与对照组相比，pH处理组的CAT活性随着胁迫时间的增加总体呈现先上升后逐渐下降的趋势，12 h时的CAT活性达到峰值，且均显著高于对照组(P<0.05)，pH为7.3、7.5的CAT活性分别为(18.89±0.48)和(17.83±0.82) U·mL-1，而pH为8.9、9.1的CAT活性分别为(19.52±0.72)和(21.55±0.4) U·mL-1；48 h时各pH处理组的CAT活性低于对照组，低pH处理组的CAT活性与对照组的差异不显著(P>0.05)，而高pH处理组的CAT活性下降幅度较大，显著低于对照组(P<0.05).

2.3 pH急性胁迫对刺参NOS活性的影响

pH急性胁迫对刺参体腔液NOS活性的影响(图3)显示：低pH处理组的NOS活性变化幅度不大，随着胁迫时间的增加总体呈现略有上升后下降的趋势，与对照组的差异不显著(P>0.05)；高pH处理组的NOS活性随着胁迫时间的增加总体呈现短暂下降后上升的趋势，24 h时大幅下降，在96 h时显著低于对照组(P<0.05)，pH为8.9、9.1的NOS活性分别为(11.86±0.34)和(11.35±0.33) U·mL-1.

2.4 pH急性胁迫对刺参LZM活性的影响

pH急性胁迫对刺参体腔液LZM活性的影响(图4)显示，与对照组相比，pH处理组的LZM活性随着胁迫时间的增加总体呈现略有上升后逐渐下降的趋势.低pH处理组的LZM活性在24 h时低于对照组，72 h时显著低于对照组(P<0.05)；高pH处理组的LZM活性在12 h时大幅下降，且显著低于对照组(P<0.05)，后略有小幅上升后又下降.与低pH处理组相比较，高pH处理组的LZM活性较低，12 h时的LZM活性显著低于低pH处理组(P<0.05).

3 讨论

3.1 pH急性胁迫对刺参非特异性免疫的影响

由于刺参属于无脊椎动物，只有非特异性免疫[17]，因此，抗氧化系统显得尤为重要.生物在受到外界胁迫时，可促使机体的酶系统和非酶系统发生反应，还原产生活性氧和氧自由基，不及时清除会造成生物体活性氧损伤[10].抗氧化酶常作为评估环境因子胁迫对生物体产生氧化胁迫效应的一类生物标志物，氧化应激产物的积累会导致水生生物生理生化功能的缺陷，影响其生长存活[8,18]，而SOD和CAT是生物体内重要的抗氧化酶，也是反映生物应对各种胁迫的重要指标[19].本研究结果表明，随着pH胁迫时间的增加，刺参体腔液的SOD和CAT活性呈先上升后下降的趋势，分析认为，pH胁迫3～12 h时刺参体内产生大量活性氧，机体抗氧化酶系统被激活.此结果与“pH急性胁迫下，中国明对虾[18]、脊尾白虾[8]和缢蛏[10]的酶活性随着胁迫时间的增加呈现峰值”的变化结果相一致.NOS是生物体非特异性免疫系统的重要组成部分，能够被诱导产生大量NO，与活性氧中间体等发生反应，从而对病原生物起到杀灭的作用[20].本研究结果显示，随着pH胁迫时间的增加，刺参体腔液的NOS活性变化不大，此结果与赵先银等[7]的研究结果一致.养殖水环境的变化往往会使水环境恶化及病菌滋生,导致刺参病原敏感性提高.LZM是一种碱性蛋白酶，能够破坏和消除进入体内的异物，增强抗菌因子的抗菌性[21].作为检测抗病力的指标，本研究结果显示，随着pH胁迫时间的增加，LZM活性呈逐渐下降的趋势，并在胁迫12 h时达到最低点，此时刺参的病原敏感性最高，这与“3种对虾的LZM活性随着pH胁迫时间的增加而逐渐下降”的结果[22]基本一致.

3.2 pH急性胁迫对刺参的毒性影响

4 结论

基于本研究结果，认为在刺参养殖的过程中，针对pH易于大幅变化的春夏季节，尤其是盐碱度较高的养殖区域，在有效调控养殖水体pH变化的同时，还应密切注意其他水质因子的变化，避免pH与其他因子协同产生叠加或累加效应，定期检测刺参SOD、CAT和LZM等敏感免疫指标，有助于了解机体的免疫能力和健康程度，对减少应激、有效预警和防控病害的发生具有重要意义.