陈思怡, 邓明雪, 陈晶伟, 方伟琦, 刘国坤, 肖 顺, 程 曦

(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建 福州 350002)

花生茎线虫(Ditylenchusarachis)是在我国山东、河北等省花生上发现的一种新病原线虫，可导致花生果荚外壳变黑腐烂，种皮变色，严重影响其产量与品质[1].前期研究发现，花生茎线虫可以侵染花生的果荚、种粒、胚栓及根茎，主要以幼虫的形态在田间残留的病果荚或种皮上越冬，成为病害的初侵染源，病害主要通过病花生种荚进行远距离传播.研究还发现，从农户家中贮藏的晒干花生果壳和种皮中可分离到大量的活线虫；将采集的干花生样本保存于实验室干燥条件下，2年内果荚和种皮中还可分离出大量活的茎线虫[2-3].这表明花生茎线虫具备强的耐低温与抗干燥能力，但其脱水休眠策略及其与线虫耐低温能力间的关系尚不明确.

线虫脱水休眠(anhydrobiosis)是指一些种类的线虫在极端的脱水状态下可进入一种代谢静止的休眠状态，一旦复水，可恢复正常的代谢活动[4-5]，如水稻干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)、草莓滑刃线虫(Aphelenchoidesfragariae)、阿姆辛基粒线虫(Anguinaamsinckia)、剪股颖粒线虫(Anguinaagrostis)、小麦粒线虫(Anguinatritici)，以及与花生茎线虫同属的甘薯茎线虫(D.destructor)和鳞球茎茎线虫(D.dipsaci)[6-7]，均可通过脱水休眠方式度过干燥环境.这些线虫通过虫体卷曲和(或)聚集两种行为反应，以及形态结构的适应性改变，来减少其体内水分的丧失[5,7].线虫脱水存活方式分为缓慢脱水策略型(slow-dehydration strategists)和快速脱水策略型(fast-dehydration strategists)两大类[8-9]，绝大多数植物寄生线虫是通过缓慢脱水策略在干燥环境下生存，而少数则采取快速脱水策略[10].温度是影响线虫生存和繁殖的重要因素，大多数植物寄生线虫在活动阶段，不耐低温，但如果进入脱水休眠状态后则可忍耐很低的温度，如鳞球茎茎线虫处于休眠状态时，可在-80 ℃下短期存活[11].然而，花生茎线虫是如何在北方干冷的条件下越冬，需要进一步研究.因此，本研究探讨花生茎线虫的脱水存活方式和耐低温能力，以及二者的相关性，以期为进一步了解该线虫的越冬和传播机理及制定防控措施提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试线虫种群培养

供试花生茎线虫种群DCPXT，采自河北省刑台花生果荚[1].采用马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)上繁殖的尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)菌丝进行培养保存[12]：挑取尖孢镰孢菌接种于培养皿(Φ=6 cm)中的PDA培养基上，28 ℃培养5 d，菌丝长满培养皿；挑取50条花生茎线虫雌虫至离心管，经0.2%硫酸链霉素浸泡消毒3～6 h，并经无菌水清洗3遍后[13]，接种在尖孢镰孢菌菌丝上，parafilm封口膜封口，28 ℃培养箱内黑暗培养25 d左右.

1.2 花生茎线虫的脱水试验

1.2.1 快速脱水 参照Winston et al[14]和Solomon et al[15]的方法，用蒸馏水、氯化钠、硝酸钙和氯化钙在干燥器内制成饱和溶液控制湿度，设置3个相对湿度：75%、50%和30%.采用改良贝曼漏斗法[16]分离培养的线虫，制成混合虫态线虫悬浮液(5 000条·mL-1)，取1 mL线虫悬浮液通过孔径1.2 μm滤膜(Φ=2.5 cm)过滤，将水滤干后，立即将滤膜分别放入上述3个相对湿度的干燥器内，每个滤膜为一个样本，每个干燥器放置21个样本，置于黑暗中脱水.每24 h取每个相对湿度处理3个样本，连续7 d.将每个样本分别置于含有5 mL无菌水的小烧杯中，室温下复水，12 h后，滤膜上的线虫进入烧杯中，充分摇匀.取1 mL悬浮液置于体视显微镜(Nikon SMZ18，含照相系统)下，观察并统计2龄幼虫(J2)、3龄幼虫(J3)或4龄幼虫(J4)(J3、J4在形态上难以区分，故合并统计)、雌虫和雄虫的存活和死亡数量，取3次重复的平均值，计算线虫的复苏率.复水后，用挑针拨动，虫体不动、僵直、透明视为死亡线虫；虫体弯曲、能动则视为存活线虫.

1.2.2 缓慢脱水 通过前期预试验建立了利用Pluronic F-127胶体脱水的方法：在10 ℃下，吸取Pluronic F-127胶体液2 mL于无菌的一次性塑料培养皿(Φ=3.5 cm)中，并加入混合虫态线虫悬浮液(5 000条·mL-1)100 μL，轻摇混匀，移去皿盖，转移至干燥器中28 ℃干燥处理.每皿为一个样本，共35个样本.5 d后，干燥器内硅胶球不再变色，胶体已失水成薄片，表明花生茎线虫随胶体缓慢失水已进入脱水休眠状态，取样并计算此时线虫复苏率，记录为0.每1周取干燥后的胶体薄片3个样本，连续5周，余下的胶体薄片继续在干燥器中保存.向干燥后的胶体中加入5 mL无菌水，室温下复水12 h，待胶体溶解后，充分摇匀，取1 mL悬浮液置于体视显微镜下，观察线虫的形态并统计各虫态的存活和死亡数量，取3次重复的平均值，计算复苏率.

1.3 花生茎线虫的耐低温试验

1.3.1 正常培养的线虫 当花生茎线虫在含有尖孢镰孢菌的培养基上培养约20 d后，将培养皿分别置于5个低温环境(10、4、-10、-20、-80 ℃)下黑暗保存，每1周取一次样品，每个处理3次重复，连续4周，以28 ℃条件下培养的花生茎线虫作为对照.取样后，将含有线虫的PDA样品在室温下放置10 min，待其解冻后切碎琼脂并加入5 mL无菌水浸泡，复水12 h.取1 mL悬浮液置于体视显微镜下，观察并统计存活和死亡的线虫总数，取3次重复的平均值，计算线虫的存活率.

1.3.2 脱水休眠状态的线虫 按照1.2.2的处理方法，当花生茎线虫随胶体缓慢失水进入脱水休眠状态时，取样并计算此时线虫复苏率，记录为0.取出琼脂膜片，保鲜膜封装，再装入自封袋内，分别放置在不同低温环境(10、4、-10、-20、-80 ℃)下保存，每1周取一次样品，每个处理3次重复，连续5周，对照为同时期在28 ℃下缓慢脱水干燥保存的休眠线虫.取样后，将样品在室温下放置10 min，加入5 mL无菌水复水，12 h后统计花生茎线虫存活和死亡数量，并计算复苏率.

1.4 数据分析

利用Excel软件对数据进行整理，结合SPSS 20.0软件对统计的数据进行单因素方差分析.其中，不同低温处理下脱水休眠线虫的复苏率采用双因素方差分析.

2 结果与分析

2.1 花生茎线虫经快速脱水处理后的复苏率

在75%相对湿度下，花生茎线虫的复苏率在第4天时急剧下降到20.70%，之后趋于稳定，第5、6、7天的复苏率分别为20.50%、20.10%、17.57%，四者间差异不显著(图1)；各虫态花生茎线虫的复苏率总体是随着培养时间的延长而下降，但同一时间不同虫态复苏率存在显著差异，干燥处理第7天时，J3+J4占比最高(9.57%)，J2次之(6.13%)，雌虫和雄虫复苏率最低(表1).在50%相对湿度下，干燥处理第1天花生茎线虫复苏率急剧下降，为9.98%，随后下降速度减缓，2～7 d复苏率为0.25%～4.75%(图1)；不同虫态的复苏率表现为J3+J4>J2>成虫(表1).在30%相对湿度下，花生茎线虫复苏率最低，第1、2、3天复苏率分别为4.84%、1.07%、0.02%，第3天存活的线虫仅为J3和J4，第4天后未见存活的线虫(图1)；不同虫态的复苏率也表现为J3+J4>J2>成虫(表1).

表1 不同相对湿度下花生茎线虫各虫态的复苏率1)

2.2 正常培养的花生茎线虫耐低温能力

在28、10和4 ℃条件下，花生茎线虫保持较高的存活率，4周后的存活率均在80%以上，且差异不显著；但在-10和-20 ℃条件下，1周后线虫存活率急剧下降，分别为13.45%和6.93%，第2周未见复苏线虫；在-80 ℃条件下保存1周的线虫全部死亡(表2).

表2 正常培养的花生茎线虫在不同温度下的存活率1)

2.3 花生茎线虫经缓慢脱水处理后的复苏率

经缓慢脱水进入休眠状态的线虫与正常状态下培养的线虫在形态上不同.正常状态下培养的花生茎线虫虫体自然弯曲，死亡后虫体僵直，略向腹面弯曲(图2A)；但经缓慢脱水进入休眠状态的线虫身体紧密卷曲，头部向内(图2B).

由图3可以看出，在28 ℃条件下缓慢脱水完成后线虫的平均复苏率为56.09%；继续干燥保存5周后线虫复苏率急剧下降至0.64%.各虫态中，J3+J4的复苏率最高，J2次之，二者间存在显著差异；成虫的复苏率最低，与幼虫间存在显著差异(表3).

表3 缓慢脱水处理后各虫态的复苏率1)

2.4 脱水休眠的花生茎线虫耐低温能力

将缓慢脱水休眠线虫置于低温条件下保存，线虫复苏率明显下降，但较28 ℃下保存的复苏率高.第5周时，-80 ℃下保存的花生茎线虫的复苏率最高； -10和-20 ℃次之；10和4 ℃保存的线虫复苏率较低(图3).

3 讨论

3.1 花生茎线虫的脱水策略

本研究明确了花生茎线虫的脱水存活方式为缓慢脱水策略型，而非快速脱水策略型，且不同虫态的抗干燥能力存在差异，表现为J3+J4>J2>成虫.该结果与鳞球茎茎线虫[17]基本一致.有研究认为：缓慢脱水策略型，也称为外部脱水策略型，主要依赖于自然环境因素，如土壤或周边生境的缓慢失水，拖延线虫进入致死的最低含水量的时间；而快速脱水策略型，也称为内在脱水策略型，在高度脱水环境下，线虫能通过生化及分子适应机制，控制体内水分缓慢流失[5,8-9].Womersley[10]研究发现，大部分线虫，特别是土壤线虫，均采用缓慢脱水策略度过干燥的环境.这些线虫在脱水时会出现聚集或卷曲两种状态，虫体卷曲可以减小暴露在干燥环境中的表面积，减少水分散失速率[18].Treonis et al[19]认为线虫卷曲是其进入脱水休眠的指标之一.花生茎线虫在快速脱水时，虫体大多不呈卷曲状，但在缓慢脱水休眠时，虫体绝大多数呈卷曲状，表明线虫卷曲是其缓慢脱水休眠的重要形态标志.

3.2 花生茎线虫的耐低温能力

花生茎线虫的耐低温能力与其脱水休眠状态密切相关.本研究发现，将花生茎线虫直接置于低温下存活率低，但经缓慢脱水休眠的线虫在低温下能长期存活，甚至在-80 ℃的条件下可保存35 d，复苏率达到31.75%.这表明花生茎线虫可能是通过一种保护性脱水的策略[20]来抵御低温的影响：当线虫进入脱水休眠状态后，新陈代谢受抑制，待环境条件适宜后，其体内线粒体活动水平提高，从而提供足够能量使其复苏.当鳞球茎茎线虫在干燥环境中处于休眠状态时，可在-80 ℃存活20 min[11].目前，除了花生茎线虫以外，只有极地生活的线虫休眠状态下能在-80 ℃存活35 d以上[20].

本研究为揭示花生茎线虫在北方花生主产区越冬存活的机理提供了依据.由于北方冬季干冷，在土壤、病残组织内的线虫可以通过缓慢脱水的方式进入休眠状态，其耐干燥能力和耐低温能力强，使其可以顺利越冬，在温度适宜的环境下复苏率高，且其生活史短、繁殖能力强，即使复苏后的线虫数量少，也可以在花生生长季节对花生产量和品质造成严重影响.