陈妙婵，蔡葵，吴敏华，陈活强，刘棋枫

(广东省佛山市第一人民医院输血科，佛山 528000)

异基因造血干细胞移植(allogeneic peripheral blood stem cell transplantation，allo- PBSCT)是指通过血细胞单采技术从供者体内获取外周血造血干细胞来进行的移植[1]。 外周血干细胞采集的数量直接决定移植的成败。 生理情况下供者外周血干细胞约占单个核细胞0.01%-0.1%, 难以满足外周血干细胞移植的需求[2]。 CD34+细胞少于0.05,需要动员使CD34+细胞增加后通过血细胞分离造血干细胞,部分供者通过常规手段无法获得足够造血干细胞, 采集前白细胞计数与外周血干细胞数、CD34+细胞数有一定相关性， 表明外周血细胞计数可作为预测采集物CD34+细胞数量的良好指标[3-5]。 目前国内对供者外周血干细胞采集影响因素的研究报道多倾向于年龄、性别、注射重组人粒细胞集落刺激因子的剂量等， 而分析动员方案与外周血造血干细胞分布规律方面的文献报道少见，本文通过回顾性分析固定时间的动员方案与非固定时间的动员方案干细胞产品的采集效率，探讨动员方案外周血的 WBC、MNC、CD34+细胞的分布规律， 拟制定干细胞采集最佳时机的临床路径，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2016-2019 年在我院行异体PBSC（peripheral blood stem cell 造血干细胞）采集的健康供者 40 例, 其中男 21 例， 女 19 例； 年龄11-58 岁，中位年龄 31 岁；身高 152-178cm，中位身高167cm；体重54-89kg，中位体重66kg；所有健康供者均接受术前检查：包括梅毒、艾滋、乙肝、丙肝等免疫学检测指标正常，肝肾功能、生化电解质，凝血功能正常，无重要器官功能障碍，所有健康供者术前充分沟通知晓方案并签储知情同意书。

1.2 主要仪器 Baxter CS-3000plus（Baxter，美国），SysmexXE－2100 型血细胞分析仪，流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国）

1.3 PBSC 动员方案

1.3.1 方案1 固定时间的动员方案25 例，于单采前5 天开始给供者皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子( rhG-CSF)10μg/（kg·d），每 12 h 一次，采用8：00、20：00 各一次。

1.3.2 方案2 非固定时间的动员方案15 例，于单采前5 天开始给供者皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子( rhG-CSF)10μg/（kg·d），2 次/d，药量同方案1，给药时间2 次/d，早上、下午各注射一次。

1.4 PBSC 产品采集

1.4.1 方案1 健康供者动员第5 天用CS-3000血细胞分离机采集PBSC。 供者于动员后第4 天采多个时间点的外周血， 即 8：00、9：00、10：00、12：00、15：00、18：00，监测 25 例健康供者其外周血的血常规以及CD34+细胞比例。 取上述不同时间点的外周血检测白细胞计数（WBC）、单个核细胞计数（MNC）与CD34+细胞数等数据绘制分布规律曲线图。 根据第4 天绘制分布规律图，第5 天取次高峰与高峰期在10:00-15:00 期间共300min 进行外周血干细胞采集，循环血量10000-15000ml（中位数为 12500），流速为 30-60ml/min，以 ACD 液为抗凝剂，取采集物少量稀释后计算MNC 和CD34+细胞，计算供者产品的细胞总量。

1.4.2 方案2 健康供者按临床现行上午、 下午各动员一次的惯例，于动员第5 天上午注射rhG-CSF 1h 后开始采集外周血干细胞共300min，循环血量10000-15000ml(中位数为12500),流速为30-60ml/min，以ACD 液为抗凝剂，取采集物少量稀释后计算MNC 和CD34+细胞比例，计算供者产品的细胞总量。

1.4.3 根据干细胞不同动员方案采集有效率比较，制定临床动员方案及采集最佳时机的临床路径。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0 软件，计量资料经正态性检验后，用均数±标准差(±s)表示，两组间计量资料比较采用独立样本t 检验，计数资料比较采用确切概率法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

40 例健康供者纳入动员方案检测范畴， 所有采集干细胞产品均进入结果分析。 固定时间的动员方案中25 例健康供者，动员后第4 天所取多个时间点的WBC、 外周血MNC、CD34+细胞比例的中位数等数据绘制趋势曲线图（图1、2、3）。不同性别的健康供者PBSC 动员后干细胞的分布规律比较见表1，差异无统计学意义（P＞0.05）。 不同动员方案采集的供者干细胞数据比较见表2。不同动员方案采集有效率比较见表3。

图1 固定时间的动员方案健康供者WBC 的分布规律

图2 固定时间的动员方案健康供者外周血MNC 的分布规律

图3 固定时间的动员方案健康供者CD34+比例的分布规律

表1 不同性别的健康供者PBSC 动员后干细胞数据比较(±s)

表1 不同性别的健康供者PBSC 动员后干细胞数据比较(±s)

性别 n 外周血单个核细胞（×109/L） 外周血CD34+（106/kg）男女P 21 19＞0.05 7.93±2.04 7.51±1.96＞0.05 6.32±1.94 5.98±1.52＞0.05

3 讨论

表2 不同动员方案采集的供者干细胞数据比较(±s)

表2 不同动员方案采集的供者干细胞数据比较(±s)

动员方案 n 产品外周血单个核细胞（×109/L）产品CD34+（106/kg）方案一方案二产品MNC（108/kg）25 15 t P 7.02±2.04 4.21±1.05 4.06<0.01 7.02±2.17 2.28±1.05 6.47<0.01 4.68±1.94 0.70±0.52 6.31<0.01

表3 不同动员方案采集有效率比较

急性髓系白血病是起原于干、 祖细胞的造血系统恶性肿瘤，具有高度异质性，异基因造血干细胞移植是目前唯一可能治愈急性白血病的手段[6,7]。有效的动员既可以最大限度保障健康供者的利益，又能提高外周血单个核细胞的采集效率，把握最佳采集时机非常关键。 通常认为，外周血干细胞MNC 达(4-8)×108/kg 以上、CD34+细胞达(4-6)×106/kg 以上是用于异基因移植的最佳剂量[8]。本研究动员后PBSC 增长的高峰期通常在第4-6 天，在这期间采集干细胞产品就能获得移植所需要的MNC和CD34+细胞,且在第5 天分离干细胞可以获得最多的干细胞，最少量的T 细胞[9]。 以往临床医生在制定干细胞移植计划时各有不同的动员方案及采集时机，存在一定的随机性，不能保证最终采集效率， 本研究采用固定时间的动员方案rhG-CSF 10μg/（kg·d），每 12h 一次，并观察动员后第 4 天的WBC、 外周血MNC、CD34+细胞比例的分布规律，从图1、2 可看出WBC、外周血MNC 数量随着注射时间的推移呈上升趋势； 图3 可见CD34+细胞比例在8:00 注射rhG-CSF1h 开始升高，4h 达到最高峰，5h 后呈下降趋势，7h 后降至低水平，此时供者的WBC 与MNC 仍呈上升趋势。 由此可得外周血MNC、CD34+细胞的变化程度不一， 但其变化趋势有一定的规律， 当给健康供者采用固定时间注射rhG-CSF 时，其外周血干细胞的分布具有可预测的规律。 本研究采用固定时间的造血干细胞动员方案， 即供者皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子10μg/（kg·d），q12h（8：00、20：00 各一次），干细胞均在 12:00 达到峰值，10:00 至 15:00 为最佳采集时机。 通过分析固定时间的动员方案与干细胞分布规律的关系， 制定干细胞采集最佳时机的临床路径， 固定时间的动员方案与非固定时间的动员方案对比， 产品MNC 采集效率提高208%， 产品CD34+采集效率提高569%。

临床上往往通过观察健康供者外周血MNC或者CD34+细胞数量， 来指导供者的采集次数与所需循环血量。白雯等[10]采用动员方案为粒细胞集落刺激因子(G- CSF) 300μg/d 动员 3d ，产品MNC与采前供者外周血MNC 呈正相关, 产品CD34+细胞数与采前供者外周血MNC 呈正相关，提示采集干细胞产品前外周血中相对高的MNC 可使产品获得较多 MNC 及 CD34+细胞。 从图1、2、3 可见，自动员方案开始实行后，WBC 与外周血MNC 总体呈上升的趋势，分布规律图符合白雯等的报道，而CD34+细胞则在 8:00 注射 rhG-CSF 后 1h 开始升高， 4h 达到最高峰，5h 后呈下降趋势。因此我们认为， 在指导选择干细胞最佳采集时机方面， 观察CD34+细胞比例的分布规律较外周血MNC 更为客观。 方案一供者干细胞采集的最终产品量MNC 能一次性获得达到最佳移植量， 超过80%产品CD34+能一次性获得达到最佳移植量，可以满足临床干细胞移植所需， 而方案二均未能一次性获得达到最佳移植量。

外周血干细胞移植的首要条件是造血干细胞有效动员和采集,并能较快持久地重建造血。 近年国内外不少单位已开展了此项工作， 但平均每例供者采集次数较多,且造血干细胞的采集效率高低差别较大[11]。PBSC 供者动员方案多样，多是每天注射rhG-CSF 两次，没有明确规定间隔时间，无干细胞动员的规律依据[12,13]。 本课题所选择的供者年龄范围广， 性别不同等因素均不会对动员后干细胞的分布规律有明显的影响。 我们认为，固定时间的动员方案可获得预期的干细胞分布规律， 从而可制定干细胞采集最佳时机的临床路径， 获得较高的采集效率。 本研究所采用的供者皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)10μg /(kg·d），每12h 一次，即 8：00、20：00 各一次的动员方案，采集时机为9:00 至14:00，能一次获得足够治疗量的造血干细胞，减少了采集所需要的时间和次数，极大的减轻了供者的痛苦与经济负担， 对外周血干细胞移植有着重要的指导意义。