彭晓杰，郑卫民，傅睿，黄玉辉，邓美慧，吴小川，陶珊珊

（江西省儿童医院肾脏科，南昌 330006）

过敏性紫癜( Henoch-Schonlein purpura，HSP)是以全身广泛性血管炎为主要病理改变的儿童常见病[1]，其导致肾脏受累的发生率国内外报道各不一致，约20 %-80%[2-4]。研究证实，过敏性紫癜患者肾脏是否受累与很多因素有关，如发病年龄、腹痛症状、皮疹持续存在、凝血因子Ⅻ活性、是否用皮质激素治疗等[5]。 患儿的预后情况与肾脏的临床表现密切相关, 过敏性紫癜肾炎 ( Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN) 是导致儿童期慢性肾脏疾病的重要原因之一[6]。

目前肾活检是判断肾脏受累与否及受累程度的金标准，但仍存在一定局限性，对FSGS 病理类型可能漏诊[7]，且按我国国情大多数患儿及家属难以接受重复肾活检。 目前尚无可靠而无创伤性的鉴别诊断方法，这给HSPN 的早期诊断及合理治疗带来障碍。 尿蛋白被公认与肾脏疾病进展相关的独立因素之一[8]，足细胞能摄取滤过的蛋白，造成细胞结构和功能改变[9]。 研究表明，当足细胞数减少10%-20%时，即开始出现肾小球硬化过程[10]，病理表现为微小病变的肾病综合征患儿， 足细胞Nephrin、Podocin 和WT1 等蛋白存在分布和表达的异常[11]，而足细胞标志性蛋白Podocalyxin 的研究更备受人们关注。 研究发现[12]，尿足细胞及肾组织Podocalyxin 的表达与肾脏病理、蛋白尿和血尿的程度有关，92.5%肾小球疾病患者尿中可检测出足细胞蛋白Podocalyxin 的表达， 其敏感性为88.4%，特异性为100%。

临床上判断肾小球疾病活动和病变严重程度主要以尿蛋白水平，血尿及白细胞尿的出现，尿系列微量蛋白如：尿微量蛋白(MA)、转铁蛋白(TRF)、IgG、α1-微球蛋白， 肾功能等作为无创评估指标，此时临床症状往往滞后于病理变化， 故而肾脏病理诊断仍是金标准。 由于肾活检是一项有创的检查方法， 而且难以用于动态追踪观察， 这无疑给HSPN 的早期诊断及病情追踪带来困难，尿足细胞检测作为一项无创检查，其特异、快捷、简便易行、可重复性能弥补肾活检的缺陷。 目前国内尚无有关HSPN 病理分类、 积分与肾组织足细胞蛋白Podocalyxin 的表达及尿中脱落足细胞Podocalyxin表达关系的报道。 本研究探讨足细胞损伤及足细胞蛋白Podocalyxin 的表达变化在HSPN 进展过程中的意义，为HSPN 的早期诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取江西省儿童医院肾脏科2015年 2 月-2017 年 6 月收治的 56 例 HSPN 患儿，均于进行抗血管炎、 激素或免疫抑制剂等治疗前行肾活检。 其中男 33 例，女 23 例，平均年龄（10.4±0.3） 岁 （3 岁 8 个月-15 岁）， 平均病程 5.3 个月（3天-38 个月）。

HSP 诊断标准：参照《诸福棠实用儿科学》提出的诊断标准： ⑴可触性紫癜；⑵突发腹痛；⑶病理切片可观察浸润的小动脉或者小静脉中性粒细胞。 （以上指标符合≥2 条可诊断）。 HSPN 诊断标准：符合2009 年中华医学会儿科学分会肾脏病学组提出的诊断标准[13]：于HSP 病程的6 个月内，出现蛋白尿和(或)血尿。 蛋白尿：符合以下任何一项即被认为是蛋白尿： ⑴一周内3 次尿常规显示蛋白阳性； ⑵24h 尿蛋白定量＞0.15g； ⑶一周内有3次尿微量白蛋白高于正常参考值的高限。

另取非肾脏疾病死亡病例尸检切取的肾脏标本4 例作为正常对照组（2 例重症肺炎，1 例先心，1 例腹膜炎死亡的新鲜标本， 经检测无肾脏损害，由我院病理科提供）。同时收集56 例HSPN 患者及8 例健康儿童（儿童保健门诊健康体检儿童，均为知情自愿者）的晨尿作尿足细胞Podocalyxin 检测。

1.2 肾组织和尿中足细胞蛋白Podocalyxin 表达肾脏病理采用 HE 染色、PAS 染色、MASSON 染色及扫描电镜检查。 肾组织和尿中足细胞蛋白Podocalyxin 表达采用免疫荧光染色。 若标本为新鲜肾组织， 则按制作冰冻切片。 小鼠抗人单克隆Podocalyxin-like1（3D3）抗体,购于北京中杉金桥生物技术有限公司, 产于美国Santa cruzbiotechnology，INC。 ZF-0312 FITC 标记山羊抗小鼠 IgG，购于北京中杉金桥生物技术有限公司， 原产地美国Zymed 公司。 染料碘化丙啶（PI），购于长沙欧迈生物科技有限公司， 原产地美国Sigma 公司。 SP-9001 免疫组化染色试剂盒， 购于北京中杉金桥生物技术有限公司，由美国Zymed 公司提供。 荧光显微镜为日本产Nikon EclipseE400 型。

1.3 结果的观察方法及判断 HSPN 病理改变按1975 年国际小儿肾脏病研究协会（ISKDC）制定的分型标准，分为六级。

HSPNⅠ：肾小球轻微异常。

HSPNⅡ：单纯系膜增生；分为：（a）局灶/阶段；（b）弥漫性。

HSPN Ⅲ：系膜增生，伴有＜50%肾小球新月体形成/节段性病变（硬化、黏连、血栓、坏死），其系膜增生可为：（a）局灶/阶段；（b）弥漫性。

HSPN Ⅳ：病变同Ⅲ级，50%-75%的肾小球有上述病变，分为：（a）局灶/阶段；（b）弥漫性。

HSPN Ⅴ：病变同Ⅲ级，＞75%的肾小球有上述病变，分为：（a）局灶/阶段；（b）弥漫性。

HSPN Ⅵ：膜增生性肾小球肾炎。

肾组织中肾小球足细胞缺失的判断： 若足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达沿肾小球毛细血管壁走行分布均匀、连续，视为表达完整；若分布不均匀或节段消失，则视为表达缺失。 尿液中足细胞蛋白Podocalyxin 的表达在荧光显微镜下观察，可见尿沉渣抗Podocalyxin 抗体荧光染色，足细胞呈圆形或椭圆形、整个细胞呈绿色荧光强度+ +，碘化丙啶复染核呈鲜红色、圆形较大、居中或偏一侧，有时足细胞被包埋在管型中；尿沉渣瑞氏染色显示红细胞、白细胞、上皮细胞；而每份标本低倍镜观察全片，高倍确认足细胞后摄像计算机储存，然后选择全片左上、左下、右上、右下和中间5 个不同部位10 个高倍视野，记录完整足细胞数。

1.4 图象分析 每例切片选取5-10 个肾小球进行图像分析， 分析软件为CMIAS 2001A 型多功能真彩色病理图像分析系统(北京麦克奥迪图像技术有限公司)，计算足细胞蛋白Podocalyxin 阳性染色面积占肾小球面积的百分比及其阳性染色的灰度(灰度值范围 0-260，0 为黑色，260 为白色) 。

1.5 统计学处理 足细胞蛋白Podocalyxin 在肾组织的表达 （阳性染色面积占肾小球面积的百分比及其阳性染色的灰度值），各组间（Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa、Ⅴb）数值以均数±标准差表示，进行单因素方差分析，应用SPSS（17.0）统计软件，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 56 例肾穿刺标本病理分型 根据肾组织HE，PAS 以及Masson 染色结果，结合电镜，共有8 种病理改变，包括紫癜性肾炎（HSPN）Ⅱa 5 例、Ⅱb 5例、Ⅲa 12 例、Ⅲb 9 例、Ⅳa 8 例、Ⅳb 8 例、Ⅴa 5例、Ⅴb 4 例。 见表1。

表1 56 例肾穿刺标本病理分型

2.2 Podocalyxin 在肾组织的表达 采用免疫荧光法检测Podocalyxin 在HSPN 各病理分级中肾组织的表达，结果显示正常肾组织及HSPN Ⅱa 肾组织可见足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达沿肾小球毛细血管壁走行分布均匀、连续，信号表达强；磷酸盐缓冲液（PBS）阴性对照肾组织肾小球毛细血管壁无阳性信号表达；HSPN Ⅱb 肾组织可见足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达沿肾小球毛细血管壁走行分布均匀、连续,信号表达较强，但毛细血管壁略显僵硬；HSPN Ⅲa 及HSPN Ⅲb肾组织可见足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达有不同程度分布不均匀或节段消失， 信号表达稍弱；HSPN Ⅳa 肾组织可见足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达有不同程度分布不均匀或节段消失,信号表达明显减弱；HSPN Ⅳb 肾组织足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达可见明显分布不均匀或节段消失， 信号表达明显减弱，新月体形成区或硬化区信号消失；HSPN Ⅴa 肾组织足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达可见明显分布不均匀或节段消失， 信号表达极度减弱， 新月体形成区或硬化区信号消失；HSPN Ⅴb肾组织可见足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达分布极度不均匀或大面积消失， 信号表达极弱，硬化区信号消失。

正常对照组、HSPNⅡa 及Ⅱb 三组肾组织Podocalyxin 染色占肾小球面积的百分比和灰度值组间两两比较无差异（P＞0.05），而Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 及Ⅴb 组肾组织足细胞蛋白Podocalyxin 阳性荧光信号表达从Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 到Ⅴb 依次下降，Podocalyxin 染色占肾小球面积的百分比和灰度值各组间两两比较有显著差异 （P＜0.01）。 见表2 及图1-10。

表2 正常肾组织及56 例HSPN 肾组织Podocalyxin 的免疫荧光分析结果（±s）

表2 正常肾组织及56 例HSPN 肾组织Podocalyxin 的免疫荧光分析结果（±s）

单因素方差分析：正常组、Ⅱa 及Ⅱb 两两相比，P 均＞0.05；Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 及Ⅴb 两两相比，P 均＜0.01

分组 例数 阳性面积占肾小球百分比（%）肾小球内阳性染色灰度值184.58±8.79 184.69±8.84 182.48±7.76 163.59±2.12 159.47±2.38 158.42±2.33 121.73±2.52 106.61±7.35 69.73±8.79正常ⅡaⅡbⅢaⅢbⅣaⅣbⅤaⅤb 4 5 5 1 2 9 8 8 5 4 2.29±0.50 2.28±0.52 2.19±0.49 1.85±0.42 1.46±0.36 1.39±0.39 1.01±0.27 0.88±0.15 0.26±0.09

图1 正 常 肾 组 织Podocalyxin 的表达（免疫荧光×400）阳性荧光信号表达沿肾小球毛细血管壁走行分布均匀、连续，信号表达强

图2 PBS 阴性对照肾组织的表达（免疫荧光×400）肾小球毛细血管壁无阳性信号表达

图3 HSPN Ⅱa 肾组织Podocalyxin 的表达（免疫荧光×400）阳性荧光信号表达沿肾小球毛细血管壁走行分布均匀、连续，信号表达较强

图4 HSPN Ⅱb 肾组织Podocalyxin 的表达（免疫荧光×400）阳性荧光信号表达沿肾小球毛细血管壁走行分布均匀、连续，信号表达较强，但毛细血管壁略显僵硬

图5 HSPN Ⅲa 肾组织Podocalyxin 的表达（免疫荧光×400）阳性荧光信号表达有不同程度分布不均匀或节段消失，信号表达稍弱

图6 HSPN Ⅲb 肾组织Podocalyxin 的表达（免疫荧光×400）阳性荧光信号表达有不同程度分布不均匀或节段消失，信号表达稍弱

图7 HSPN Ⅳa 肾组织Podocalyxin 的表达（免疫荧光×400）阳性荧光信号表达有不同程度分布不均匀或节段消失，信号表达明显减弱

图8 HSPN Ⅳ b 肾 组 织Podocalyxin 的表达 (免疫荧光×400) 阳性荧光信号表达可见明显分布不均匀或节段消失,信号表达明显减弱，新月体形成区或硬化区信号消失

图9 HSPN Ⅴ a 肾 组 织Podocalyxin 的表达 (免疫荧光×400) 阳性荧光信号表达可见明显分布不均匀或节段消失,信号表达极度减弱，新月体形成区或硬化区信号消失

2.3 尿足细胞Podocalyxin 的表达 采用间接免疫荧光法检测尿足细胞Podocalyxin 的表达， 可见足细胞Podocalyxin 阳性荧光染色显示尿足细胞呈圆形或椭圆形、整个细胞呈绿色荧光强度++～+++；以碘化丙啶复染足细胞核显示尿大鼠足细胞标记蛋白（PCX）的表达，可见复染尿足细胞核呈鲜红色、圆形较大、居中或偏一侧，有时足细胞被包埋在管型中； 结果显示： 正常对照组尿足细胞均阴性；HSPN Ⅱa 及Ⅱb 组尿中亦未检出足细胞；12 例HSPN Ⅲa 有 8 例尿足细胞阳性(占 66.7%)，每例检出足细胞数(6±0.4)；9 例 HSPNⅢb 有 8 例阳性(占88.9%)，每例足细胞数(6±0.6)；8 例 HSPNⅣa 有 7例阳性 (占 87.5%)， 每例足细胞数 (8±1.4)；8 例HSPN Ⅳb 有 8 例阳性(占 100%)，每例足细胞数(7±1.3)；5 例 HSPN Ⅴa 有 4 例阳性(占 80.0%)，每例足细胞数(8±3)；4 例 HSPNⅤb 有 4 例阳性(占 100%)，每例足细胞数(9±3.2)。 见表3 及图11-12。

表3 正常肾组织及56 例尿足细胞Podocalyxin 的免疫荧光分析结果

3 讨论

过敏性紫癜肾炎 （Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是指过敏性紫癜累及肾脏，是由含IgA 的免疫复合物沉积于肾小球所引起的一种循环免疫复合物病，属继发性IgA 肾病。1975 年国际小儿肾脏病研究协会（ISKDC）根据病理改变将紫癜性肾炎分为六型（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型），其中Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型根据系膜增生程度又分为a（局灶性）和b（弥漫性）。 本研究共收集 56 例 HSPN 患儿，其中Ⅱ型 10 例(17.86%)，Ⅲ型 21 例(37.50%)，Ⅳ型 16 例(28.57%)，Ⅴ型 9 例(16.07%)，以Ⅲ型及Ⅳ型为多见，未收集到Ⅰ型及Ⅵ型患者，病理类型与文献报道相似[14]。

图11 尿足细胞PCX 的表达(足细胞核碘化丙啶复染×400) 显示复染尿足细胞核呈鲜红色、圆形较大、居中或偏一侧,有时足细胞被包埋在管型中

图12 尿足细胞浆PCX 的表达（免疫荧光×400）荧光染色显示尿足细胞呈圆形或椭圆形、整个细胞呈绿色荧光强度++～+++

在肾小球脏层上皮细胞（足细胞，podocyte）上存在多种特异性标志物， 如Nephrin、Synaptopodin(PP44)、WT-1 、GLEPP-1 、Podocalyxin(PCX)及 C3b受体等[15]，研究发现表达其他几种标志蛋白的足细胞几乎都表达PCX， 故通常仅以抗PCX 单克隆抗体用于鉴别足细胞[12]。研究发现足细胞上标志性蛋白Podocalyxin，由肾小球内皮细胞和足细胞合成，初步认为在成熟的足细胞[16]，通过Na/H 交换调控因子(NHERF2) /ezrin 复合体对足细胞骨架形成和维持起重要作用， 它是肾小球主要带负电荷的蛋白分子，组成基底膜（GBM）电荷屏障，并通过电荷的排斥作用来维持足突间犬牙交错的空间结构，对肾小球滤过屏障起负调节作用， 同时有可能阻止壁层细胞对足细胞的黏附[17]。 许多研究表明[12,18]，在多种不同肾小球疾病肾组织中表达的足细胞蛋白以PCX 在尿足细胞的阳性表达率最高(73.8%)，故本研究采用足细胞蛋白PCX 作为尿足细胞的特异性诊断。

本研究显示， 正常对照组、HSPNⅡa 及Ⅱb 组肾组织无异常增殖性或渗出性改变， 其Podocalyxin 阳性荧光信号表达沿肾小球毛细血管壁走行分布均匀、连续，肾组织Podocalyxin 染色占肾小球面积的百分比和灰度值组间比较无差异，且尿中足细胞检测均阴性， 提示肾小球滤过膜足细胞损伤轻微，无足细胞脱落，肾小球基底膜无明显结构改变，与光镜染色相符；而当HSPN 肾小球内出现明显系膜增殖伴有局灶或广泛新月体形成或纤维化时， 自HSPN Ⅲa 至Ⅴb 组肾组织阳性荧光信号表达均有不同程度分布不均匀或节段消失，或呈颗粒状表达，图象显示肾小球毛细血管壁染色有不同程度中断或缺失，Ⅴa 组肾组织荧光信号表达极度减弱，Ⅴb 组肾组织几乎无足细胞蛋白Podocalyxin 的荧光信号表达，从Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴa 到Ⅴb 组，其肾组织 Podocalyxin 染色占肾小球面积的百分比和灰度值依次下降 (P<0.01)，且尿中都不同程度检出足细胞蛋白Podocalyxin，可见尿足细胞浆PCX 荧光染色显示尿足细胞呈圆形或椭圆形、整个细胞呈绿色荧光强度++～+++，复染尿足细胞核呈鲜红色、圆形较大、居中或偏一侧，有时足细胞被包埋在管型中， 提示肾小球滤过膜有足细胞的严重损伤， 肾小球基底膜上的电荷屏障发生改变，肾小球发生明显结构的异常，与文献报道的结果一致[19,20]。 局灶节段肾小球硬化(FSGS)和微小病变型肾病综合征(MCNS)临床上均可表现为大量的蛋白尿，足细胞可出现明显的结构变化，但MCNS 的蛋白尿和足细胞改变均为可逆性，而FSGS 则不然。

关于足细胞从GBM 上分离的机制目前尚不完全清楚，细胞骨架蛋白、整合素蛋白(如31 整合素和Dystroglycan)可能在其中起一定的作用[21]，本实验采用间接免疫荧光法以抗PCX 单克隆抗体对尿沉渣进行染色，也证实尿沉渣中常见的红细胞、白细胞、上皮细胞都不着色，仅足细胞显现绿色荧光强度达+++，核复染显示完整细胞核，表明本实验方法可用于检测尿足细胞。Hara 等[22]在多种肾小球疾病患者的尿中找到了足细胞特异性标志蛋白染色阳性的细胞；Petermann 等[23]把 Heymann 肾炎模型大鼠尿中的细胞用来培养, 细胞仍可贴壁存活，且证实这些细胞主要是足细胞，说明活的足细胞可以从GBM 脱落并从尿中排出；同时也提示除细胞凋亡外, 足细胞脱落可能还存在其它原因,如GBM 被基质金属蛋白酶 ( matrix metalloproteinases，MMPS)或组织蛋白酶等降解破坏[24]，或 GBM被活性氧氧化损伤,或足细胞骨架蛋白发生重组[25],这些都可以削弱足突与GBM 的粘附连接，导致细胞从GBM 上剥离、脱落。

关于HSPN 的临床和病理间的相互关系，有报道指出，一种临床类型可有多种病理改变，而某一病理改变又可有不同的临床表现。 病理类型为轻微改变者临床多表现为单纯蛋白尿； 最初表现为肉眼血尿和 (或) 持续镜下血尿但无持续大量蛋白尿者，呈Ⅲ级或Ⅲ级以下的肾小球病变；临床上呈肾炎或肾病表现，或为持续大量蛋白尿者有10%-20%机会患有Ⅳ-Ⅴ级肾小球病变；兼有肾炎-肾病临床表现者60%患IV-V 级肾小球病变[26]。 HSPN急性期以后，部分患儿呈现慢性进展过程，临床上表现为持续蛋白尿、高血压及肾功能逐步减退，病理上呈肾小球硬化改变。 本研究结果显示，HSPN从病理改变Ⅲ型开始其肾组织足细胞蛋白Podocalyxin 的表达强度出现减弱,随病理改变程度的进一步加重, 肾组织足细胞蛋白Podocalyxin 的表达强度逐步减弱，直至几乎消失，同时尿中出现足细胞蛋白Podocalyxin 的表达。

研究发现在HSP 起病后1-6 个月内作第一次肾活检，肾脏病理分级为Ⅳ-Ⅴ级的患儿，后期随访结果显示几乎100%预后较好 (正常或镜下血尿或蛋白尿<1g/d)，这个出乎意料的结果可能是与早期联合应用免疫抑制药有关；而II-Ⅲ级的患儿预后却很差， 其原因可能是由于作第一次肾活检的时间太早， 其结果还来不及反映肾脏受损的严重程度，当数月至数年后行第二次肾活检时，都已是Ⅴ级[27]。因此不能仅凭第一次肾活检结果或某一个影响预后的因素就决定紫癜性肾炎患儿的预后。

本研究结果表明，各病理类型HSPN 检测尿足细胞蛋白Podocalyxin 阳性者其阳性率无统计学差异，且尿足细胞数大致相等，可能与样本含量较小有关， 或尿足细胞蛋白Podocalyxin 的表达强度与肾组织本身病理改变的程度并无相关， 其结果有待进一步验证。 但对于尿足细胞蛋白PCX 染色阳性的HSPN 患者已预示着其病情正处在进展过程中，其肾小球开始出现新月体，并逐步向慢性纤维化进展。 大量研究显示HSP 病初的临床表现和肾脏病理改变程度及进展有很大关系， 长期随访及合理治疗对判断预后十分重要， 本研究结果显示尿足细胞蛋白Podocalyxin 的检测可作为无创评估HSPN 肾脏病理进展的指标之一，可能对病情随访追踪和预后判断提供帮助。

总之，随着HSPN 病理改变的加重，足细胞蛋白Podocalyxin 在肾组织的表达呈下降趋势， 可能提示足细胞损伤在HSPN 病理进展中发挥一定作用。 Ⅲ型以上HSPN 尿足细胞蛋白Podocalyxin 检测阳性，提示尿足细胞检测可能反映HSPN 病理损害程度。