黄敏，陈颖，成水芹，韩丽君，李靖

（中国人民解放军东部战区总医院 1.药品科，2.肾脏科，江苏 南京 210000）

糖尿病肾病（diabetes nephropathy, DN）是糖尿病较严重的并发症。其主要是以肾小球中系膜细胞增生、肾小球硬化及基底膜增厚为病理表现[1]。随着糖尿病发病率逐年升高，预计至2030年糖尿病患者将达3.66 亿，DN 患者将超过1 亿[1]。目前，临床常通过限制蛋白饮食的摄入、控制血压及血糖基础治疗，同时采用血管紧张素受体阻滞剂（angiotensin receptor blocker, ARB）进行DN 治疗[2]。骨化三醇作为一种活性维生素D，在临床得到广泛使用。已有研究[3]表明，其不仅能改善胰岛素的抵抗，还有一定的抗炎作用。近年来发现血清Klotho是一种调控衰老相关的基因，与许多疾病发生、发展以及预后有关，已被证实其与DN 的严重程度有关[4]。Vaspin 是一种脂肪因子，通过对胰岛素的增敏以及抑制炎症的作用进一步保护肾脏，被证实与DN 的发展密切相关[5]。本研究通过将骨化三醇与坎地沙坦联合用于早期DN 的治疗，评估其治疗效果，以及对肾功能、血脂、肾间质纤维化指标的影响，同时观察Klotho、Vaspin 表达水平的差异。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2018年1月中国人民解放军东部战区总医院收治的DN 患者100例。以随机数字表法分成观察组和对照组，每组50例。研究经本院医学伦理委员会批准（批件号：KY-201601），患者签署知情同意书。

纳入标准：①有糖尿病病史，并符合糖尿病诊断标准[6]；②Mogensen 分期[7]Ⅲ期（UAER 30 ～300 mg/24 h）。排除标准：①原发或继发其他疾病所致的肾脏疾病；②由酮症酸中毒、原发性高血压或泌尿系感染等所致尿蛋白升高者；③合并炎症应激反应者；④对骨化三醇过敏者；⑤肿瘤患者。

1.2 药物、试剂与仪器

坎地沙坦片（天津武田药品有限公司，批准文号： 国药准字J20110008），骨化三醇胶丸（上海罗氏有限公司，批准文号：国药准字J20150011），AU-640 型号生化分析仪（日本奥林巴斯公司），DG5033A 全自动酶标仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司），酶联免疫吸附法检测试剂盒（广州润坤生物科技有限公司），总RNA 试剂盒（美国Biomiga 公司），定量酶联免疫吸附试验试剂盒（上海歌凡生物科技）。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组所有患者糖尿病饮食、适当运动，给予降糖药或注射胰岛素，控制FBG＜7 mmol/L、HbA1c＜ 7%；口服坎地沙坦片，8 mg/次，1 次/d。

1.3.2 观察组在对照组的基础上加用骨化三醇胶丸，0.25 μg/次，1 次/d，口服。两组均治疗3 个月。

1.4 评估标准及检测指标

1.4.1 临床疗效评估标准[8]比较两组治疗3 个月后的临床疗效。无效：症状及体征无好转，24 h 尿蛋白含量减少＜30%，Scr 减少＜10%；有效：症状及体征较前好转，24 h 尿蛋白含量减少30%～50%，Scr 减少10%～30%；显效：症状及体征明显好转，24 h 尿蛋白含量减少≥50%，Scr 减少≥30%。总有效率=（显效+有效）/总例数×100%。

1.4.2 肾功能和血脂的检测均于治疗前及治疗3个月后采集患者空腹肘静脉血各4 ml，3 000 r/min 离心，取上清液，应用AU-640 型生化分析仪检测肾功能（UAER、Scr、BUN）、血脂[总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）]。。

1.4.3 肾间质纤维化指标的检测两组患者于治疗前及治疗3 个月时，采集患者空腹肘静脉血各4 ml，3 000 r/min 离心，取上清液，应用DG5033A 型全自动酶标仪，用酶联免疫吸附法检测转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、血清同型半胱氨酸（Homocysteine, Hcy）水平。

1.4.4 血清Klotho mRNA 的检测两组患者于治疗前及治疗3 个月时，采集空腹肘静脉血，3 000 r/min 离心，取上清液，运用Trizol 的总RNA 试剂盒进行总 RNA 的提取，以紫外分光光度计进行样品纯度的检测， 当A260 与A280 的比值≥1.80 为合格样品。再将总 RAN 用逆转录试剂盒逆转录成模板单链的cDNA，并以之为模板运用PCR 试剂盒进行PCR 反应。Klotho基因和内参引物的序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。Klotho，正向5'-ACCTG GTGGCGCACAC-3'，反向5'-TTGGCAAACCAACCTAG TACA-3'；GAPDH，正向5'-GACCTGGTGGCGCACAC -3'， 反 向5'-GAAGATGGTGGTGATGGGATTTC-3'。反应条件：94℃水浴5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，持续36 个循环，每个样本均设3 个平行的反应复孔。最后再以2-ΔΔCt方法计算血清Klotho mRNA 的相对表达量[5]。

1.4.5 血清Vaspin 的检测两组患者于治疗前及治疗3 个月时，采集空腹肘静血各4 ml，3 000 r/min 离心，分离血清，置于-40℃冷冻保存。以酶联免疫吸附测定血清Vaspin 的含量。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用成组t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料

两组治疗前的性别、年龄、BMI、HbA1c、FBG、Scr、BUN、UAER、SBP 及DBP 比较，差异无统计意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组的一般资料比较 （n =50）

表2 两组的疗效比较 （n =50）

2.2 两组临床疗效比较

两组治疗总有效率比较，差异有统计学意义（χ2= 4.760，P=0.029），观察组高于对照组。见表2。

2.3 两组治疗前后的肾功能比较

两组治疗前Scr、BUN、UAER 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后Scr、BUN、UAER 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组较对照组降低。见表3。

表3 两组治疗前后肾功能的比较 （n =50，±s）

表3 两组治疗前后肾功能的比较 （n =50，±s）

组别Scr/（μmol/L）t 值 P 值BUN/（mmol/L）t 值 P 值UAER/（mg/24 h）t 值 P 值治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后观察组 104.62±15.57 70.22±9.55 13.317 0.000 8.88±1.73 6.02±1.44 8.985 0.000 182.95±21.83 121.98±9.05 18.244 0.000对照组 105.02±17.62 88.71±16.82 4.734 0.000 9.09±1.94 7.92±1.22 3.601 0.001 179.61±24.37 153.21±16.42 6.353 0.000 t 值 0.120 6.760 - - 0.571 7.119 - - 0.722 11.778 - -P 值 0.905 0.000 - - 0.569 0.000 - - 0.472 0.000 - -

2.4 两组治疗前后血脂比较

两组治疗前TC、TG、LDL、HDL 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后TC、TG、LDL 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组较对照组降低；两组治疗后HDL 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

2.5 两组肾间质纤维化指标比较

两组治疗前Hcy、VEGF、TGF-β1比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后Hcy、VEGF、TGF-β1比较，差异有统计学意义（P＜0.05），两组治疗后Hcy、VEGF、TGF-β1较治疗前降低，观察组较对照组降低。见表5。

2.6 两组治疗前后Klotho、Vaspin 的比较

两组治疗前Klotho、Vaspin 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组治疗后Klotho、Vaspin 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组治疗后Klotho、Vaspin 水平均升高，且观察组较对照组高。见表6。

表4 两组治疗前后血脂的比较 （n =50，mmol/L，±s）

表4 两组治疗前后血脂的比较 （n =50，mmol/L，±s）

组别TC t 值 P 值TG t 值 P 值治疗前 治疗后 治疗前 治疗后观察组 6.38±3.08 4.34±1.38 4.274 0.000 3.14±1.69 1.89±0.93 4.582 0.000对照组 6.14±2.95 5.07±1.83 2.179 0.032 3.09±1.41 2.45±1.74 2.021 0.046 t 值 0.398 2.252 - - 0.161 2.007 - -P 值 0.692 0.027 - - 0.873 0.048 - -组别LDL t 值 P 值HDL t 值 P 值治疗前 治疗后 治疗前 治疗后观察组 3.41±1.31 2.17±0.92 5.477 0.000 1.28±0.63 1.33±0.21 0.532 0.596对照组 3.09±1.53 2.60±0.73 2.044 0.045 1.22±0.91 1.25±0.53 0.201 0.841 t 值 1.123 2.589 - - 0.383 0.992 - -P 值 0.264 0.011 - - 0.702 0.325 - -

表5 两组治疗前后肾纤维化指标的比较 （n =50，±s）

表5 两组治疗前后肾纤维化指标的比较 （n =50，±s）

组别Hcy/（μmol/L）t 值 P 值VEGF/（pg/ml）t 值 P 值TGF-β1/（pg/ml）t 值 P 值治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后观察组 29.61±4.14 13.84±1.68 24.958 0.000 426.7±27.48 347.3±24.03 15.38 0.000 194.7±21.07 153.1±19.01 10.366 0.000对照组 29.54±4.12 19.28±2.52 15.022 0.000 426.6±27.54 395.6±25.02 5.891 0.000 194.6±21.03 168.7±20.04 6.304 0.000 t 值 0.085 12.701 - - 0.018 9.845 - - 0.024 3.993 - -P 值 0.933 0.000 - - 0.986 0.000 - - 0.981 0.000 - -

表6 两组治疗前后的Klotho、Vaspin 水平比较 （n =50，±s）

组别Klotho mRNA 相对表达量t 值 P 值Vaspin/（ng/L）t 值 P 值治疗前 治疗后 治疗前 治疗后观察组 1.57±0.14 2.87±0.23 34.14 0.000 1.4±1.12 2.4±0.93 4.857 0.000对照组 1.58±0.13 1.99±0.26 9.973 0.000 1.3±1.21 1.9±0.92 2.791 0.006 t 值 0.370 17.926 - - 0.429 2.703 - -P 值 0.712 0.000 - - 0.669 0.008 - -

3 讨论

DN 常在糖尿病起病10年后发生，发病率占40%～ 50%[9]。由于起病隐匿，微量的白蛋白尿是早期DN 的唯一表现，容易被忽视，一旦发展至大量蛋白尿，则病情快速恶化难以逆转，故及早开始治疗干预尤其重要。坎地沙坦属于ARB，可通过对肾脏血流动力学、滤过膜通透性的改善及尿蛋白排出的减少等作用进一步保护肾脏[10]。而骨化三醇可通过补充维生素D3 降低炎症因子水平，改善炎症状态[11]，从而对肾脏起保护作用。

研究结果显示，治疗后观察组治疗有效率92%高于对照组76%，两组Scr、BUN、UAER 均较治疗前降低，且观察组低于对照组，治疗后两组肾间质纤维化指标VEGF、TGF-β1、Hcy 均降低，观察组改善程度优于对照组。提示骨化三醇联合坎地沙坦可改善肾功能，降低肾脏纤维化，并提高临床疗效。可能原因为坎地沙坦通过降低肾小球滤过压以减少尿蛋白的排出，并降低成纤维细胞、系膜细胞及巨噬细胞活性来抑制肾小球代偿性肥大，促使基质蛋白酶降解进一步分解细胞基质；而骨化三醇通过改善炎症状态来抑制炎症对肾脏的损伤。故两者的联用能减少蛋白尿排泄量，阻止肾小球硬化，从而改善肾功能。

本研究结果显示，两组TC、TG、LDL 较治疗前均降低，观察组低于对照组，可能为骨化三醇补充活性维生素D 增强胰岛素敏感性[2]，而坎地沙坦也被临床证实对胰岛素的敏感性有改善作用。两者的联用起到叠加作用，使交感神经活性降低，减少机体产热，血脂代谢得以恢复正常，从而使血脂得以改善。

血清Klotho属于抗衰老相关基因，在人类的染色体上Klotho基因定位在13 号，其基因的编码区包含内含子4 个及外显子5 个，共转录3 036 个mRNA[12]。人体胰岛β 细胞可通过特异表达血清Klotho 来增加β 细胞的数量、抑制β 细胞的凋亡、促使胰岛素的分泌及对氧化应激的抑制等进而保护胰岛β 细胞的功能，从而延缓糖尿病的进展[13]。Klotho 主要由肾脏的远曲小管上皮细胞及脑脉络膜分泌，已被研究证实为早期诊断DN 的标志物[14]。本研究发现，骨化三醇联合坎地沙坦可升高血清Klotho 水平。推测血清Klotho 具有抑制炎症反应及抗氧化应激的作用。骨化三醇通过对胰岛素敏感性的增强控制血糖、对活性维生素D 的补充降低炎症因子，共同减轻炎症反应，从而负反馈降低血清Klotho 水平。吴锋等[15]研究中也证实在2 型糖尿病患者中补充维生素D 可改善其血糖控制和炎症反应。血清Vaspin 属于丝氨酸蛋白酶的抑制剂，由内脏的脂肪组织分解而来[16]。它和抗胰蛋白酶的同源性约占40%，主要由中心环1 个、β折叠3 个及仪螺旋9 个共同组成，它的二级结构相似于丝氨酸的蛋白酶阻滞剂[17]。本研究结果显示，血清Vaspin 高表达可以降低机体TNF、hs-CRP、IL-6、IL-1β 的水平，达到抗炎的作用。宫相翠等[18]研究中发现，DN 患者中炎症指标和血清Vaspin 水平呈反比，而本研究在加入骨化三醇治疗后，亦通过发挥抗炎作用负反馈升高血清Vaspin 水平，与宫相翠研究结果一致。

综上所述，骨化三醇与坎地沙坦联合应用于早期DN 不仅可以减少尿蛋白排泄、阻止肾脏纤维化、改善肾功能及血脂，同时还可提高血清Klotho 及Vaspin表达水平。但由于本研究纳入病例有限，尚需大规模研究得以证实。