陈星星 宋丽 谷风林 吴桂苹 陶锐

摘  要：本文以黑胡椒粉为原料，采用三相分离法（TPP）提取胡椒油树脂，研究了胡椒粉添加量、硫酸铵质量浓度、提取液与叔丁醇体积比、pH、温度对胡椒油树脂得率及胡椒碱含量的影响，并通过响应面试验优化了胡椒油树脂的提取工艺。结果表明：最佳提取条件为胡椒粉添加量5%、硫酸铵质量浓度10%、提取液与叔丁醇的体积比1∶0.5、pH 4、温度20 ℃，在此条件下，黑胡椒油树脂得率为12.90%，黑胡椒油树脂中胡椒碱含量为30.46%，验证试验与模型预测值基本相符。研究结果为工业化提取胡椒油树脂提供参考。

关键词：胡椒油树脂;三相分离法;胡椒碱;提取

中图分类号：S573; TS205      文献标识码：A

Abstract： In this study， three phase partitioning （TPP） was employed to extract the pepper oleoresin from black pepper powder. The effects of the addition amount of pepper powder， ammonium sulphate concentration， ratio of crude extract to t-butanol， pH and temperature on the yield of pepper oleoresin and piperine content were studied. In addition， the extraction process of pepper oleoresin was optimized by a response surface test. The optimal condition obtained was as follow： the addition amount of pepper powder 5%， ammonium sulphate concentration 10%， ratio of crude extract to t-butanol 1∶0.5， pH 4 and temperature 20 ℃. Under the optimal conditions， the yield of black pepper oleoresin and piperine content was 12.90% and 30.46%， respectively. The results provide a reference for the industrial extraction of pepper oleoresin.

Keywords： pepper oleoresin; three phase partitioning; piperine; extraction

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.023

胡椒（Piper nigrum L.）是一種多年生热带作物，完全成熟后具有典型的攀援特征，胡椒的商业和营养潜力为其赢得了“香料之王”的美誉。由于惊人的香味，胡椒在食品行业中常被用作食品添加剂，具有防腐[1]和抗氧化作用[2]。在传统医学中用于治疗感冒、发烧和许多炎症性疾病[3-4]。

胡椒油树脂是采用有机溶剂提取胡椒中的风味活性物质所得的粘稠、颜色较深的膏状物，既包含了胡椒碱、胡椒精油以及色素等物质，也包含了胡椒主要的营养成分和药用成分，保持着胡椒特有的辛辣味，可以直接食用，能够改善食物香味，是一种重要的食品添加剂[5]。鉴于胡椒油树脂的诸多优点，在食品行业中，人们逐渐用胡椒油树脂代替胡椒粉和胡椒粒等产品。胡椒碱是胡椒辣味的来源主成分，其含量的高低可以用来评价胡椒油树脂的品质[6]。胡椒油树脂提取物具有抗炎、抗抑郁、镇痛、抗风湿等特性[7-9]。在与其他药物联合治疗癌症时，它增加了其他药物的生物利用度和有效性[10]。鉴于这些药用特性，有必要寻找一种既有效又高效的提取方法，以提高胡椒油树脂产量和质量。

胡椒油树脂的提取方法主要有溶剂浸提法[11]、微波辅助提取法[12]、超声波辅助提取法[13]、超声微波辅助提取法[14]和超临界CO2提取法[15]等。有机溶剂浸提胡椒油树脂的过程中，有机溶剂消耗大，胡椒油树脂有效成分可能会有损失。而且有机溶剂如乙醇、甲醇等沸点低，在工业化生产中易挥发，对环境污染大，不易回收，对于小型工厂来说难以满足安全生产的要求。微波辅助提取法和超声辅助提取法所得胡椒油树脂得率高，但需价格不菲的仪器购买和维护费用。超临界CO2提取法最大优势在于无有机溶剂残留，但操作过程中所需器材数量巨大且价格昂贵，对于胡椒油树脂中的非挥发性成分无法充分提取[16]。鉴于上述方法存在成本高、溶剂消耗量大、选择性差等缺点，全球正在寻找廉价、快速、绿色的萃取方式。

三相分离（three phase partitioning ， TPP）法建立于1982年，是一种简单、较新的生物分离技术，被用于提取各种生物大分子。在微生物、植物或动物细胞匀浆中加入硫酸铵和叔丁醇，静置一段时间即可形成三相，由上至下依次为有机相（油脂等油溶性物质）、蛋白质层、水相（糖类等水溶性物质）[17]。一般情况下，叔丁醇与水完全混溶，但加入适当浓度的硫酸铵后，叔丁醇与水分层，且密度相差较大[17]。高浓度的硫酸铵赋予水较高的介电性，叔丁醇层实际上为疏水层，它被排除在水之外，将亲脂成分提取出来，极性成分集中在水相中[18]。

目前TPP已被研究者较多地用于酶和蛋白质的分离[19-23]，但利用TPP提取油脂物质的文献却很少。目前研究人员利用三相分离法从芒果仁、大豆[24]、米糠中提取油[25]，从姜黄[26]、生姜[27]中提取油树脂，以及提取可可果仁脂肪[28]。

本研究采用三相分离法提取胡椒油树脂，并测定了胡椒碱含量，旨在得到胡椒碱含量较高的胡椒油树脂，并对其加工工艺进行响应面优化。研究了胡椒粉添加量、硫酸铵质量浓度、提取液与叔丁醇比例、pH、温度等工艺参数对油树脂得率及胡椒碱含量的影响。研究结果对扩展三相分离体系在油树脂提取方面的应用具有积极意义。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  黑胡椒粉（过60目筛），由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供。

叔丁醇、硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、95%乙醇，均为分析纯，西陇化工股份有限公司;甲醇（色谱纯），西陇化工股份有限公司;胡椒碱（标准品），北京世纪奥科生物技术有限公司。

1.1.2  仪器与设备  AL04电子天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司;S475-B多参数测试仪，上海梅特勒托利多仪器有限公司;MTV-100多管旋涡混匀仪，杭州奥盛仪器有限公司;SY11型电热恒温水浴锅，常州恒隆仪器有限公司;Avanti J-30I高速冷冻型离心机，美国Beckman Coulter公司;IKA旋转蒸发仪，广州仪科科技公司;Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2  方法

1.2.1  三相分离法提取胡椒油树脂  取0.5 g胡椒粉末于50 mL离心管中，加入10 mL蒸馏水并充分混匀，加入一定质量硫酸铵，涡旋搅拌5 min使硫酸铵固体充分溶解之后用1 mol/L的HCl或NaOH溶液调节溶液pH，然后按照与提取液体积比加入叔丁醇，涡旋搅拌5 min，在特定温度水浴锅中静置1 h，6400 r/min离心20 min，形成三相。将含胡椒油树脂的有机相转移至已称质量的旋转蒸发瓶中，旋转蒸发回收叔丁醇后得胡椒油树脂，旋转蒸发瓶烘干至恒重后称质量。按照下列公式计算胡椒油树脂得率：

得率=提取所得胡椒油树脂质量/提取用胡椒粉质量×100%

1.2.2  胡椒碱的含量测定[29]  参照GB/T 17528- 2009的方法测定胡椒碱含量。具体为：量取50 mL 95%乙醇于旋转蒸发瓶中，待油树脂完全均匀化后，吸取1 mL溶液至100 mL棕色容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度线，稀释液经0.45 μm滤膜过滤后，用HPLC测定，采用外标法定量。色谱条件为：色谱柱为C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動相为甲醇水溶液（体积比为77∶23），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测器波长为343 nm，进样量为10 μL。

1.2.3  单因素实验  分别对胡椒粉添加量（2.5%、5%、10%、15%、20%）、硫酸铵质量浓度（10%、20%、30%、40%、50%）、pH（4、5、6、7、8）、提取液与叔丁醇的体积比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5）、温度（20、30、40、50、60 ℃）进行单因素实验，以胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量为考察指标，确定各因素的最佳选择范围。

1.2.4  响应面法实验设计  在单因素实验结果的基础上，利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面优化实验，选择pH、提取液与叔丁醇体积比、温度三个因素为自变量，以胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量为响应值，设计三因素三水平响应面实验，试验因素水平值及编码值见表1。

1.3  数据分析

所有数据采用Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0、Design Expert 8.0.6、Origin 8.0软件处理。

2  结果与分析

2.1  单因素试验

2.1.1  胡椒粉添加量  由图1可知，随着胡椒粉添加量的增加，胡椒油树脂得率先急剧下降后逐渐趋于稳定，胡椒碱含量先下降后升高。胡椒油树脂得率随着胡椒粉添加量的增加而降低，可能是因为缺乏足够的水来完成硫酸根离子的水合作用。在三相分离过程中，水与硫酸铵一起构成水相，起到分散悬浮原料的作用。胡椒粉添加量为2.5%时，胡椒油树脂得率达24%，以95%乙醇溶解旋转蒸发瓶中油树脂时，发现油树脂不能完全溶解，推断其中可能含有杂质;此外，考虑到放大生产时，胡椒粉添加量过低会带来溶剂消耗多和旋蒸时间长等成本增加的风险。综合考虑这两个原因，选择胡椒粉添加量为5%进行下一步实验。

2.1.2  硫酸铵质量浓度  由图2可知，随着硫酸铵质量浓度的增加，胡椒油树脂得率降低，胡椒碱含量升高。硫酸铵质量浓度为10%时，胡椒油树脂得率最高。综合考虑，选择硫酸铵质量浓度为10%。

在三相体系形成过程中，溶液中硫酸铵解离出大量的NH4+、SO42，解离出的离子结合水分子后产生盐析效应，使蛋白质疏水沉淀，由于蛋白质的析出与相结合的油脂析出息息相关，所以这可能是硫酸铵质量浓度影响油树脂得率的原因[19]。但具体作用情况依原料品种而定。Gaur等[24]发现50%的硫酸铵质量浓度为提取芒果仁油脂的最佳浓度，30%的硫酸铵质量浓度为提取大豆油和米糠油的最佳浓度。Varakumar等[16]在提取生姜油树脂时，发现添加10%的硫酸铵得到的生姜油树脂得率最高。

2.1.3  pH  由图3可知，随着pH的增加，胡椒油树脂得率先增加后降低，在pH为5时油树脂得率最高，油树脂中胡椒碱含量最低。胡椒油树脂得率和胡椒碱含量随着pH变化而变化的原因可能是，pH影响三相体系中蛋白质层的析出，从而影响油树脂的析出。当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，此时溶液中硫酸铵电离出的硫酸根阴离子可与蛋白质正电荷结合，使蛋白质结构紧缩、沉淀析出，而蛋白质层的析出又影响溶液中胡椒油树脂的析出，从而影响油树脂中胡椒碱的含量[24]。

2.1.4  提取液与叔丁醇体积比  由图4可得，随着提取液与叔丁醇体积比增加，胡椒油树脂得率先升高后下降，之后趋于稳定，胡椒碱含量先下降后升高。在体积比为1∶1时油树脂得率最高。提取液与叔丁醇体积比从1∶0.5增加到1∶1时，油树脂得率增加，原因可能是叔丁醇的增加有助于单位体积内油树脂在水相和有机相间的传质。当提取液与叔丁醇体积比大于1∶2后胡椒油树脂得率趋于稳定可能是因为胡椒油树脂已大部分被提出。

2.1.5  温度  由图5可知，随着温度的升高，胡椒油树脂得率先升高后下降，在40 ℃时得率最高。油树脂中胡椒碱含量呈先下降后升高的趋势。油脂的溶出属分子扩散过程，温度升高，分子扩散系数增大，扩散速度提高，因而油树脂得率增加。但温度继续上升，油树脂得率下降，原因可能是过高的温度对三相体系稳定性造成一定的破坏。

2.2  响应面试验

2.2.1  试验设计与结果  进行三因素三水平的Box-Benhnken 中心组合试验设计，考察pH（A）、提取液与叔丁醇体积比（B）、温度（C）对胡椒油树脂得率与油树脂中胡椒碱含量的影响，试验设计及结果见表2。

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到胡椒油树脂得率（R1）对自变量A、B、C的三元二次回归方程如下：

R1=16.440.52A+0.005B+0.15C0.46AB+0.81AC+1.53BC0.68A23.72B20.78C2

对回归方程进行显著性分析，结果如表3所示，该模型的P<0.01，说明实验选择的二元多项模型极显著;失拟项P>0.05，模型失拟项不显 著，可以用该回归方程对胡椒油树脂得率进行预测和分析。

其中模型的A、AC、BC、A2、B2、C2为极显著，AB为显著。由pH（A）、提取液与叔丁醇的体积比（B）、温度（C）3个影响因素的F值可知，各单因素对胡椒油树脂得率影响的大小依次为：A>B>C;交互项对胡椒油树脂得率影响的大小依次为：BC>AC>AB。

同样对表2中胡椒油树脂中胡椒碱含量进行回归拟合和方差分析，结果见表3，得到油树脂中胡椒碱含量（R2）对自变量A、B、C的拟合方程如下：

R2=24.11+0.58A0.14B+0.36C+0.72AB+1.79AC1.36BC+0.49A2+7.96B20.36C2

该模型的P<0.01，说明实验选择的二元多项模型极显著;失拟项P>0.05，模型失拟项不显著，说明该回归方程拟合度较好，模型试验误差小，可以用该回归方程对胡椒油树脂中胡椒碱含量进行预测和分析。

其中模型的AC、B2为极显著，BC为显著。

由pH（A）、提取液与叔丁醇的体积比（B）、温度（C）3个影响因素的F值可知，各单因素对胡椒油树脂中胡椒碱含量影响的大小依次为：A>C> B;交互项对胡椒油树脂中胡椒碱含量影响的大小依次为：AC>BC>AB。

2.2.2  各因素间的相互作用  利用Design-Expert 8.0.6软件绘制因子间的响应曲面图，考察所拟合的响应曲面形状，分析因素间的交互作用对胡椒油树脂得率和树脂中胡椒碱含量的影响，其响应曲面分别见图6和图7。

根据图6可以看出，提取液与叔丁醇体积比和温度对胡椒油树脂得率的影响最大，pH和温度对胡椒油树脂得率的影响次之，对胡椒油树脂得率影响最小的是pH和提取液与叔丁醇体积比。

根据图7可以看出，pH和温度对胡椒碱含量的影响最大，提取液与叔丁醇体积比和温度对胡椒碱含量的影响次之，pH和提取液与叔丁醇体积比对胡椒碱含量的影响最小。

2.2.3  验证试验  经响应面分析，综合考虑胡椒油树脂的提取得率及胡椒碱含量，得到三相分离法提取胡椒油树脂的最佳工艺条件为pH 4.00、提取液与叔丁醇体积比1∶0.53、提取温度20.19 ℃，预测的油树脂得率为13.93%，胡椒碱含量为31.83%。

为方便操作，修正后的提取条件为pH 4、提取液与叔丁醇体积比为1∶0.5、提取温度为20 ℃，该条件下得到的胡椒油树脂得率为12.90%，油树脂中胡椒碱含量为30.46%。试验结果与理论值接近，说明响应曲面分析所得的模型具有参考价值。

3  讨论与结论

近年来随着胡椒在食品和医药方面的广泛应用，囊括了胡椒几乎所有香气成分的胡椒油树脂受到越来越多的关注，众多学者对胡椒油树脂的提取进行了研究。周雪敏等[11]采用有机溶剂（乙醇）浸提法提取胡椒油树脂，在响应面优化的工艺條件下，黑胡椒油树脂得率为10.86%，黑胡椒油树脂中胡椒碱含量为38.73%。周叶燕等[12]研究了微波辅助法提取黑胡椒油树脂，实验结果为黑胡椒油树脂的得率为12.69%。吴桂苹等[30]以95%的乙醇为萃取溶剂，采用热回流提取、索氏抽提、超声波提取、微波提取、超声波-微波辅助等方法来提取胡椒油树脂，结果表明，超声-微波辅助提取可得到得率最高（17.23%）的胡椒油树脂，油树脂中胡椒碱含量为42.20%。上述提取胡椒油树脂的方法都存在乙醇用量大、易挥发等缺点，且超声-微波辅助提取所用设备及设备维修昂贵，均限制胡椒油树脂的工业生产。周雪敏[31]采用超临界CO2提取胡椒油树脂，在最优条件下得到胡椒油树脂得率为0.818%，树脂中胡椒碱的含量为 25.65%。该方法优势在于无有机溶剂残留、安全无毒，但胡椒油树脂得率低，且操作成本高。

三相分离法提取油树脂简单易操作，叔丁醇可回收，挥发到空气中的有机试剂含量小，对空气污染小。Varakumar等[16]采用三相分离法提取生姜油树脂，在硫酸铵质量浓度10%、生姜粉添加量5%、提取液与叔丁醇体积比为1∶0.5、pH为5的条件下，生姜油树脂得率最高，为17.3%。Kurmudle等[26]采用三相分离法提取姜黄姜油树脂，在硫酸铵质量浓度30%、提取液与叔丁醇体积比为1∶1的条件下姜黄油树脂得率最高。

本研究采用三相分离法提取胡椒油树脂，考察胡椒粉添加量、硫酸铵质量浓度、pH、提取液与叔丁醇体积比和温度对胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量的影响。选择胡椒粉添加量为5%，硫酸铵质量浓度为10%，在单因素实验的基础上，选取pH、提取液与叔丁醇体积比和温度为自变量，以胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量为响应值，根据Box-Behnken 设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法优化提取工艺，建立了响应值和各个因素之间的数学模型。结果表明，三相分离法提取胡椒油树脂的最佳工艺条件为胡椒粉添加量为5%、硫酸铵质量浓度为10%、pH 4、提取液与叔丁醇体积比1∶0.5、温度20 ℃，在最优条件下，胡椒油树脂得率和油树脂中胡椒碱含量分别达12.90%和30.46%。三相分离法操作简便、耗时短、成本低，体系中的有机溶剂可以回收重复利用，有利于胡椒油树脂工业化生产。

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