（广州市第十二人民医院 血液科，广东 广州 510620）

再生障碍性贫血（以下简称再障）是一种主要由T淋巴细胞免疫紊乱介导的获得性骨髓造血功能衰竭症，主要表现为全血细胞减少，可出现较严重的感染、贫血及出血。随着免疫抑制剂治疗及造血干细胞移植技术的发展，该病的预后得到大大改善。尽管如此，仍有部分患者对免疫抑制剂治疗不耐受、无效[1-2]。本课题组前期应用白细胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）体外处理的自体外周血单个核细胞治疗约200例再障患者，获得约80%总有效率及30%完全缓解率，未发现严重不良反应，为再障患者提供了开创性的可选择的疗法，但缺乏系统的机制探索[3-7]。T淋巴细胞功能亢进及多种与造血有关的正负调控细胞因子分泌异常在再障的发生、发展及临床转归中起着重要作用。因此，本实验通过观察IL-2/GM-CSF体外处理的外周血单个核细胞对再障小鼠T淋巴细胞亚群比例及造血细胞因子水平的影响来探讨再障细胞治疗的机制，为临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

清洁级雌性BALB/c小鼠（H-2d，Mlsb）42只，8～10周龄，体重16～18 g，由广东省医学实验动物中心提供。其中6只不做任何处理的小鼠作为对照组；24只小鼠复制免疫介导模型后作为模型组和干预组，模型组12只小鼠输注生理盐水，干预组12只小鼠输注细胞。剩余12只小鼠采集外周血单个核细胞。清洁级DBA/2小鼠（H-2d，Mlsa）3只，雌雄兼用，6～14周龄，体重16～20 g，作为胸腺、淋巴结细胞供体，由广东省医学实验动物中心提供。动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002。

1.2 模型复制

依据参考文献[8]和[9]，将3只DBA/2小鼠颈椎脱臼处死，常规消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、肠系膜等处淋巴结，分别获胸腺、淋巴结细胞悬液，细胞浓度为5×106个/ml，按胸腺细胞与淋巴结细胞1∶2 混合，获得胸腺淋巴结细胞悬液。用台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞＞95%。雌性BALB/c小鼠经5.5 Gy（1.1 Gy/min，5 min）60Co γ-射线全身照射，照射后4 h 内经尾静脉注入DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞（1×106个/只）。小鼠照射后立即移入SPF级无菌层流室内，饮用加入庆大霉素（40万u/L）和二性霉素B（50 mg/L）的高压灭菌水。

1.3 外周血单个核细胞分离、培养

参考课题组前期动物实验方法[10]，将12只健康BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，常规消毒，无菌心脏采血，分离单个核细胞。加入含10%胎牛血清RPMI 1640培养基（美国Invitrogen公司），添加小鼠IL-2（2 ng/ml）、GM-CSF（1 ng/ml）、钙离子载体（100 ng/ml）（美国Sigma公司）等刺激因子，置于37℃、饱和湿度的二氧化碳培养箱培养48 h。

1.4 细胞输注

参考课题组前期动物实验方法[10]并优化方案，收集上述培养后的细胞，调整细胞浓度为5×106个/ml，干预组再障小鼠模型复制第1、2、4及6 天经尾静脉各输注1次，每只小鼠输注细胞数为1×106个（0.2 ml）/次。模型组小鼠每次输注等体积无菌生理盐水。对照组小鼠不做任何处理。

1.5 观察指标及结果分析

每日观察并记录小鼠活力、形态、饮食、体重等一般情况。于模型复制第7、14、21及28天断尾采血检测外周血WBC、Hb及PLT。于模型复制第28天或濒死时处死小鼠，对照组小鼠也同步处死。取股骨冲洗，收集骨髓计数有核细胞（粒系、红系和淋巴细胞比例及巨核细胞数），摘眼球采血用流式细胞仪检测外周血CD3+CD4+（T 辅助细胞、Th 细胞）、CD3+CD8+（T 抑制细胞、Ts细胞）及CD4+CD25+CD127-（调节性T细胞、T-regs）细胞比例（小鼠单克隆抗体购自美国Becton Dickinson公司），采用ELISA 法检测血清中TNF-α、γ 干扰素（IFN-γ）水平，ELISA试剂盒购自奥地利Bender Medsystems公司。

通过比较各组小鼠一般情况及外周血细胞计数、骨髓有核细胞计数了解再障模型复制是否成功，了解干预组小鼠骨髓造血是否改善。通过比较各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群比例及造血细胞因子水平，寻找规律，探索机制。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差 （±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞输注对再障小鼠一般情况的影响

对照组、模型组、干预组小鼠模型复制前体重分别为（17.1±0.8）、（17.2±0.7）和（17.1±0.6）g，经方差分析，差异无统计学意义（F=0.068，P=0.934）。模型组和干预组模型复制后较对照组一般情况差，且行动迟缓、弓背、竖毛及食量减少。模型复制第7天，模型组和干预组饮食、饮水明显减少，体重减少。模型复制第14天，干预组一般情况逐渐好转，活动增多，弓背、竖毛逐渐好转，饮食、饮水量增加，体重增加；模型组小鼠一般情况无改善，且开始出现死亡。对照组、模型组、干预组小鼠模型复制第28天体重分别为（22.1±0.8）、（18.9±0.8）和（21.5±0.7）g，经方差分析，差异有统计学意义（F=36.844，P=0.000）；模型组较对照组和干预组轻（P＜0.05），干预组接近对照组（P＞0.05）。模型组共死亡4只，干预组无死亡。

2.2 细胞输注对再障小鼠外周血细胞计数的影响

各组小鼠不同时间点外周血WBC比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组和干预组较对照组低（P＜0.05），干预组在第21和28天较模型组高（P＜0.05）。见表1。

各组小鼠不同时间点外周血PLT比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组和干预组较对照组低（P＜0.05），干预组在第21和28天较模型组高（P＜0.05）。见表2。

各组小鼠第7天外周血Hb比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组小鼠第14、21和28天外周血Hb水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组和干预组较对照组低（P＜0.05），干预组在第28天较模型组高（P＜0.05）。见表3。

表1 各组小鼠不同时间点外周血WBC比较 （×109/L，±s）

表1 各组小鼠不同时间点外周血WBC比较 （×109/L，±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05。

组别 第7天 第14天 第21天 第28天对照组 8.4±1.4 7.6±0.8 8.2±1.3 8.2±1.3模型组 3.6±0.9① 2.9±1.1① 2.5±0.8① 2.4±0.6①干预组 3.6±0.8① 2.9±1.0① 4.6±1.0①② 5.6±1.3①②F值 57.041 52.060 64.959 46.743 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各组小鼠不同时间点外周血PLT比较 （×109/L，±s）

表2 各组小鼠不同时间点外周血PLT比较 （×109/L，±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05。

组别 第7天 第14天 第21天 第28天对照组 529.8±47.0 583.2±55.4 555.0±47.6 571.5±73.8模型组 122.7±22.8① 103.7±21.7① 100.2±20.3① 96.7±22.5①干预组 128.3±20.8① 118.0±20.0① 285.4±38.5①② 397.6±40.0①②F值 493.196 580.010 310.146 198.409 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各组小鼠不同时间点外周血Hb比较 （g/L，±s）

表3 各组小鼠不同时间点外周血Hb比较 （g/L，±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05。

组别 第7天 第14天 第21天 第28天对照组 150.7±16.1 157.4±15.3 158.7±16.7 154.0±14.6模型组 147.2±14.0 122.5±18.7① 110.7±15.3① 109.0±16.7①干预组 145.7±15.7 126.6±16.9① 116.1±18.7① 134.6±18.7①②F值 0.224 8.690 16.520 12.058 P值 0.800 0.001 0.000 0.000

2.3 细胞输注对再障小鼠骨髓有核细胞计数的影响

各组小鼠骨髓粒系比例、红系比例、淋巴细胞比例及巨核细胞数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组和干预组粒系比例、红系比例及巨核细胞数较对照组低，淋巴细胞比例较对照组高（P＜0.05），结合上述模型组一般情况差和外周血细胞计数降低，提示再障模型复制成功。干预组骨髓粒系比例、红系比例及巨核细胞数较模型组高，淋巴细胞比例较模型组低（P＜0.05），结合上述干预组小鼠一般情况改善和外周血细胞计数升高，提示干预组小鼠骨髓造血改善。见表4。

2.4 细胞输注对再障小鼠外周血T淋巴细胞亚群比例的影响

各组小鼠外周血Th 细胞比例、T-regs细胞比例及Ts细胞比例比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组Th 细胞比例、T-regs细胞比例较对照组低（P＜0.05），Ts细胞比例较对照组高（P＜0.05）；干预组Th 细胞比例、T-regs细胞比例较模型组高，Ts细胞比例较模型组低（P＜0.05）；干预组与对照组小鼠外周血Th 细胞比例、T-regs细胞比例及Ts细胞比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

2.5 细胞输注对再障小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平的影响

各组小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组较对照组高（P＜0.05），干预组较模型组低（P＜0.05）；干预组与对照组小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表4 各组小鼠骨髓粒系比例、红系比例、淋巴细胞比例及巨核细胞数比较 （±s）

表4 各组小鼠骨髓粒系比例、红系比例、淋巴细胞比例及巨核细胞数比较 （±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05。

组别 n 骨髓粒系比例/% 红系比例/% 淋巴细胞比例/% 巨核细胞数/个对照组 6 56.5±2.2 20.3±2.4 22.1±1.6 40.2±2.9模型组 8 18.7±1.6① 9.4±1.4① 69.7±4.3① 5.9±2.0①干预组 12 38.7±2.7①② 15.1±1.7①② 43.9±3.4①② 28.7±3.5①②F值 475.755 64.919 338.065 255.692 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 各组小鼠外周血Th 细胞比例、T-regs细胞比例及Ts细胞比例和TNF-α、IFN-γ水平比较 （±s）

表5 各组小鼠外周血Th 细胞比例、T-regs细胞比例及Ts细胞比例和TNF-α、IFN-γ水平比较 （±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05。

组别 n Th 细胞比例/% T-regs细胞比例/% Ts细胞比例/% TNF-α/（ng/L）IFN-γ/（ng/L）对照组 6 37.1±2.8 8.5±1.6 13.6±2.7 330.4±45.7 267.7±43.9模型组 8 23.3±2.5① 3.7±1.1① 25.5±2.5① 543.3±97.2① 355.5±58.7①干预组 12 34.3±3.4② 7.2±1.3② 15.9±3.8② 351.8±47.1② 282.1±32.4②F值 44.419 26.065 29.839 25.088 8.826 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001

3 讨论

再障发病机制极为复杂，主要涉及免疫功能紊乱、造血微环境异常和造血干/祖细胞缺陷，其中T淋巴细胞免疫功能紊乱导致造血干/祖细胞损伤是发病的主要环节[11-12]。目前认为T细胞可通过以下3种重要途径导致骨髓衰竭：①直接损伤造血干/祖细胞，抑制其增殖；②造成细胞因子分泌紊乱，正负调控造血细胞因子失调，尤其是IFN-γ、TNF-α 等造血抑制因子明显升高，参与抑制造血；③直接或通过造血细胞因子间接诱导造血干细胞或祖细胞发生凋亡[11-12]。T淋巴细胞功能亢进及多种与造血有关的正负调控细胞因子分泌异常在再障的发生、发展及临床转归中起着重要作用。因此，本实验拟通过观察IL-2/GM-CSF体外处理的外周血单个核细胞对再障小鼠T淋巴细胞亚群比例及造血细胞因子水平的影响，来探讨再障细胞治疗的机制。

本研究成功复制了再障小鼠模型，再障小鼠模型复制后一般情况较差，行动迟缓、弓背及竖毛，饮食、饮水减少，体重减轻，外周血细胞计数减少，骨髓粒系比例、红系比例及巨核细胞数下降，淋巴细胞比例升高。其中接受细胞输注的干预组小鼠，模型复制第14天一般情况开始好转，第21天外周血细胞水平开始改善，第28天体重及外周血细胞水平、骨髓有核细胞比例均升高，而模型组小鼠一般情况无改善，外周血细胞水平及骨髓有核细胞比例均无改善。结果表明，输注IL-2/GM-CSF体外处理的外周血单个核细胞后再障小鼠骨髓造血功能得到显著改善。

有研究表明，再障患者体内CD8+T淋巴细胞（Ts细胞）数量增加、功能增强，是骨髓造血衰竭的直接原因；活化的Ts细胞通过释放穿孔素、颗粒酶B 等直接杀伤造血细胞，同时还分泌IFN-γ、TNF-α 等造血负调控细胞因子，表达上调的负调控因子一方面直接抑制造血细胞的增殖、分化，另一方面诱导造血细胞发生凋亡；活化的Ts细胞还通过Fas/FasL 通路的异常活化介导骨髓单个核细胞凋亡，直接损伤造血干细胞或组细胞[13-16]。

有研究也证实，CD4+T淋巴细胞平衡紊乱也是再障骨髓造血衰竭的重要原因，包括Th 细胞（Th1 细胞、Th2 细胞）、T-regs细胞比例失衡等；T-regs细胞通过抑制自身反应性效应T细胞来控制自身免疫的发生、发展，再障患者体内Thl 比例明显增高，T-regs细胞数量降低、功能减弱，免疫抑制功能缺陷导致对效应T细胞的免疫监控能力下降，从而介导骨髓造血功能损伤[17-20]。淋巴细胞亚群紊乱导致再障患者血液中造血负调控细胞因子IFN-γ、TNF-α 等显著上调，加重免疫炎症反应，进一步促进再障的发生、发展。

本研究发现，模型组小鼠外周血Th 细胞、T-regs细胞比例较对照组降低，Ts细胞比例较对照组升高，TNF-α、IFN-γ水平较对照组升高，而干预组Th 细胞、T-regs细胞比例较模型组升高，Ts细胞比例较模型组降低，TNF-α、IFN-γ水平较模型组降低。该结果提示，T淋巴细胞亚群紊乱、T细胞异常活化及造血负调控细胞因子水平升高参与模型复制后再障小鼠疾病的发生、发展，而细胞输注有助于上调Th 细胞比例、Ts细胞比例，下调T-regs细胞比例及造血负调控细胞因子TNF-α、IFN-γ，从而发挥其促造血作用。

综上所述，本研究提示输注IL-2/GM-CSF体外处理的外周血单个核细胞有助于调节再障小鼠T淋巴细胞亚群紊乱、下调造血负调控细胞因子，从而改善骨髓造血功能，为自体外周血单个核细胞治疗再障患者的临床研究提供了理论依据。