韩晓丽 席作武 王凯 杨传广

(河南中医药大学 1第二临床医学院，河南 郑州 450000；2第二附属医院肛肠科)

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其病情隐匿，发现时多是晚期，放化疗也是目前有效的治疗手段，但会产生一系列不良反应〔1〕。近年来随着中医药的发展，它在治疗结肠癌化疗副反应上起到了一定作用，也取得了一定的进步〔2〕。钩藤是我国传统中药，具有抗炎、抗病毒和免疫应激等效应，其主要活性物质为生物碱，而毛钩藤碱是从钩藤分离得到的一种有效生物碱，且毛钩藤碱对心血管具有保护作用〔3〕。且研究发现钩藤生物碱提取物及其单体成分不仅具有抑制多种肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡等活性，还具有逆转肿瘤多药耐药活性的作用〔4〕。白细胞介素(IL)-6、信号转导和转录活化因子(STAT)3在结肠癌组织中均高表达，参与结肠癌的发生发展〔5〕。本研究旨在探讨毛钩藤碱对IL-6/STAT3信号通路的调控作用及其对结肠癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 结肠癌细胞SW480购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；MTT试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)试剂盒、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、放射免疫沉淀实验(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗体购自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 结肠癌细胞SW480用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，每天换液一次，待细胞融和至70%左右时，加入胰蛋白酶进行消化传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2药物处理与分组 参考翟娜娜等〔6〕所用的毛钩藤碱浓度，当细胞融和至70%左右时，将细胞传代接种至96孔板中，并用不同浓度的毛钩藤碱(150、300、600 μmol/L)处理SW480细胞，设为毛钩藤碱150 μmol/L组、300 μmol/L组、600 μmol/L组；未经任何处理的SW480细胞作空白对照(NC)组，DMSO处理SW480细胞作为DMSO组，5 mg/L紫杉醇处理SW480细胞作为阴性对照组，为TAX 5 mg/L组。

1.2.3噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 在以上各组细胞培养至48 h时加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液，继续孵育4 h；弃去多余培养基并加入150 μl DMSO振荡反应10 min，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞抑制率(%)=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。每组重复3次。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各组细胞，离心收集各组细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞。依据试剂盒说明书，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度。实验重复3次。

1.2.5qRT-PCR检测IL-6、STAT3和VEGF基因表达水平 收集各组细胞，研磨充分后加入Trizol试剂提取总RNA，微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度。使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系，以β-actin为内参进行PCR扩增，每个样品重复3次，循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.6Western印迹检测蛋白表达 收集各组细胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000 r/min离心15 min，收集蛋白上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行SDS-PAGE后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h。分别加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，Tris盐吐温缓冲液(TBST)洗膜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，后在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。每个蛋白样品重复3次。

1.2.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6的含量 以上各组细胞离心取上清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.2.8统计学分析 采用SPSS20.00软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1不同浓度的毛钩藤碱对结直肠癌细胞增殖的抑制作用 与DMSO组相比，TAX 5 mg/L组结直肠癌细胞的抑制率显著升高，与DMSO组和TAX 5 mg/L组相比，不同浓度毛钩藤碱处理组结直肠癌细胞的抑制率逐渐显著升高，呈浓度依赖型(均P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度的毛钩藤碱作用不同时间抑制结直肠癌细胞增殖及CyclinD1、MMP2和Caspase-3表达

2.2不同浓度的毛钩藤碱对结直肠癌细胞凋亡的诱导作用 NC组凋亡率为〔(4.23±0.35)%〕,与DMSO组〔(7.61±0.62)%〕比较，TAX 5 mg/L组结直肠癌细胞的凋亡率〔(13.83±0.93)%〕显著升高，与DMSO组和TAX 5 mg/L组比较，不同浓度毛钩藤碱处理组结直肠癌细胞的凋亡率逐渐显著升高，呈浓度依赖型〔毛钩藤碱150 μmol/L组(12.43±0.73)%、300 μmol/L组(15.73±1.08)%、600 μmol/L组(26.48±1.28)%，均P<0.05〕。见图1。

图1 流式细胞仪检测结直肠癌细胞凋亡率

2.3不同浓度的毛钩藤碱对结肠癌细胞中细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)2和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达的影响 与DMSO组比较，TAX 5 mg/L组、毛钩滕碱各浓度组结直肠癌细胞中CyclinD1、MMP2表达水平显著降低，Caspase-3表达水平显著升高(均P<0.05)；与TAX 5 mg/L组比较，毛钩藤碱300、600 μmol/L组结直肠癌细胞中CyclinD1、MMP2表达水平显著降低，Caspase-3表达水平显著升高，呈浓度依赖型(均P<0.05)。见表1，图2。

1～6：NC组、DMSO组、毛钩藤碱150 μmol/L组、毛钩藤碱300 μmol/L组、毛钩藤碱600 μmol/L组、TAX 5 mg/L组

2.4不同浓度的毛钩藤碱对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 与DMSO组比较，TAX 5 mg/L组、毛钩藤碱各浓度组结直肠癌细胞的迁移和侵袭数量显著降低(均P<0.05)，与TAX 5 mg/L组相比，毛钩藤碱300、600 μmol/L组结直肠癌细胞的迁移和侵袭数量逐渐显著降低，呈浓度依赖型(均P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度的毛钩藤碱抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭个)

2.5不同浓度的毛钩藤碱对结肠癌细胞中IL-6、STAT3和VEGF mRNA表达的影响 与DMSO组比较，TAX 5 mg/L组结直肠癌细胞中IL-6、STAT3和VEGF mRNA的表达水平，但差异无统计学意义(P>0.05),毛钩滕碱各浓度组IL-6、STAT3、VEGF mRNA表达水平显著降低(均P<0.05)；与TAX 5 mg/L组比较，毛钩藤碱300、600 μmol/L组结直肠癌细胞中IL-6、STAT3和VEGF表达水平逐渐显著降低，呈浓度依赖型(均P<0.05)。见表3。

2.6不同浓度的毛钩藤碱对结肠癌细胞中IL-6、STAT3、和VEGF蛋白表达的影响 NC组IL-6含量为〔(245.79±36.72)pg/ml〕;与DMSO组〔(236.56±32.54)pg/ml〕比较，TAX 5 mg/L组结直肠癌细胞中IL-6的含量显著降低〔(175.91±28.34)pg/ml;P<0.05〕；与DMSO组和TAX 5 mg/L组比较，不同浓度毛钩藤碱处理组结直肠癌细胞中IL-6的含量逐渐显著降低〔毛钩藤碱150 μmol/L组(124.87±23.40)pg/ml、300 μmol/L组(73.95±16.41)pg/ml、600 μmol/L组(48.65±14.65)pg/ml，均P<0.05〕。与DMSO组比较，TAX 5 mg/L组、毛钩藤碱各浓度组结直肠癌细胞中VEGF、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)；与TAX 5 mg/L组比较，毛钩藤碱300、600 μmol/L组结直肠癌细胞中VEGF、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平逐渐降低(均P<0.05)。见表3，图3。

表3 不同浓度的毛钩藤碱对结肠癌细胞中IL-6、STAT3和VEGF mRNA、STAT3、VEGF表达的影响

1～6：NC组、DMSO组、毛钩藤碱150 μmol/L、毛钩藤碱300 μmol/L组、毛钩藤碱600 μmol/L组、TAX 5 mg/L

3 讨 论

结直肠癌近年来发病率、死亡率逐渐上升，严重威胁着人类的健康。新辅助化疗治疗早期结直肠癌、靶向药物治疗结直肠癌肝转移疗效较好〔7〕。而且研究表明，中医药辅助放化疗及手术治疗结肠癌患者，能改善患者的预后，提高患者的身体状况，在治疗结肠癌方面发挥着重要的作用〔8〕。毛钩藤碱是中药钩藤的吲哚生物碱，能抑制登革热病毒生命周期的晚期步骤〔9〕。毛钩藤碱可下调MMP9蛋白表达水平，在体外抑制缺氧诱导的人乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭〔6〕。毛钩藤碱可诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡，可能与其调低Bcl-2/Bax蛋白比值，活化Caspase-9和Caspase-3有关〔10〕。毛钩藤碱可以抑制人肺癌细胞的生长，通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β途径诱导细胞凋亡〔11〕。本研究中，毛钩藤碱可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡；还抑制CyclinD1、MMP2蛋白的表达，促进Caspase-3蛋白的表达。

IL-6可以调节细胞增殖分化，炎症反应和免疫反应等；STAT3是参与信号转导和转录激活的重要转录因子，其持续活化与多种肿瘤的发生发展有关；IL-6是STAT3的激活因子，可以活化STAT3，进而促进其下游的信号转导，而活化的STAT3调控炎性细胞因子的表达，持续活化的IL-6/STAT3可促进肿瘤的发展〔12〕。研究发现IL-6/STAT3通路的高表达可促进耐药蛋白及抗凋亡蛋白表达，诱导卵巢癌的铂类耐药〔13〕。激活IL-6/酪氨酸激酶(JAK)2/STAT3信号通路会增强肺癌细胞的转移〔14〕。晚期糖基化终末产物(AGEs)能够通过JAK2/STAT3信号通路促进结肠癌SW480细胞的增殖，抑制凋亡，增强侵袭、迁移能力〔15〕；而阻断IL-6/STAT3通路，抑制IL-6的生成可以抑制结肠癌的增殖〔16，17〕。本研究结果发现IL-6、STAT3的表达下降时细胞凋亡增多，验证了IL-6/STAT3与结肠癌的进展相关，且毛钩藤碱可抑制IL-6、STAT3和VEGF的表达。

越来越多的研究发现，不同的中药通过IL-6/STAT3通路可以影响不同肿瘤的发生发展。如消癌解毒方通过抑制IL-6/STAT3信号通路，上调Cleaved Caspase-3的表达可以促进肿瘤细胞凋亡〔18〕。白藜芦醇通过抑制IL-6调节JAK2/STAT3信号通路可诱导伯基特淋巴瘤细胞凋亡〔19〕。马钱子碱通过抑制IL-6/STAT3信号通路可诱导结肠癌SW480细胞凋亡〔20〕。白花蛇舌草通过抑制STAT3信号通路也可以抑制结肠直肠癌的生长〔21〕。马齿苋多糖早期调控IL-6/STAT3信号通路能够降低结肠癌的发病率〔22〕。而本研究结果发现毛钩藤碱可通过抑制CyclinD1、MMP2蛋白的表达，促进Caspase-3蛋白的表达，从而抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡。