李旭 陈岚 岳园 于军

(1吉林大学第一医院药学部，吉林 长春 130021；2长春市中心医院检验科；3吉林大学基础医学院)

肝癌是全球第六大常见癌症〔1〕，近年来中老年肝癌发病率呈上升趋势，病情进展迅速，预后不良，对人类健康构成严重威胁〔2〕。中国肝癌死亡占世界的53%，主要影响到中老年人〔3〕。肝癌几乎总是由潜在的疾病引起，但这种疾病的来源在世界各地差别很大，包括乙型肝炎病毒(HBV)〔4〕、不良饮食和缺乏活动〔5〕及真菌毒素〔6〕。肝癌通常预后差，5年生存率估计低于9%〔7〕。

苦参碱(Matrine)是传统中药苦参〔8〕中的一种重要成分〔9，10〕，它是一种喹啉类生物碱，其分子式为C15H24N2O，苦参碱已被验证具有广泛的药理作用〔11，12〕，如抗乙肝病毒治疗慢性乙型肝炎等〔13〕。近年来，大量文献报道苦参碱具有良好的抗癌活性〔14〕。本文拟分析苦参碱对肝癌细胞HepG2生长、凋亡的作用及机制。

1 材料与方法

1.1试剂与药物 苦参碱(上海源叶生物科技有限公司)纯度≥98%，环磷酰胺为上海华联制药有限公司生产，RPMI1640培养基(Gibco公司生产)，胎牛血清(FBS，Biological industries)；Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒和增强型细胞计数试剂盒(CCK)-8(碧云天)。

1.2细胞株 HepG2肝癌细胞由吉林大学基础医学院病原生物学系常规传代培养。

1.3主要仪器设备 基础电泳仪Bio-Rad，紫外透射仪：北京六一；凝胶成像分析系统：上海富山；聚合酶链反应仪(PCR)，电热恒温培养箱：中仪国科(北京)科技有限公司；二氧化碳培养箱MCO-175，倒置荧光摄影分析显微镜LX71：奥林帕斯；BD公司流式细胞仪：ACCURI C6；全波长酶标仪：瑞士Tecan。

1.4肝癌细胞培养 用含10% FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2恒温恒湿培养。2～3 d换液1次，细胞长至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化并按1∶2比例传代。冻存细胞时，将细胞悬浮于含90%FBS、10%二甲基亚砜(DMSO)的DMEM冻存液中。细胞培养传代数在30～40代之内，取对数生长期细胞用于实验。

1.5贴壁细胞 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μl，铺板使待测细胞浓度为5×104/孔，边缘孔用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)填充。5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物。5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。每孔加入20 μl噻唑蓝(MTT)溶液(5 mg/ml)，继续培养。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD450 nm处测量各孔的吸光值。苦参碱配制为1 g/L的无菌溶液备用。用完全培养基逐级稀释制成浓度依次为0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0 mg/ml的苦参碱工作溶液备用。

1.6体外抑制肝癌HepG2细胞实验 将HepG2细胞调整为5×104个/孔。接种96孔细胞培养板，每孔200 μl，分别加入不同浓度苦参碱，每种浓度8个复孔，另设环磷酰胺对照，分别0.062 5，0.125 0，0.250 0，0.500 0，1.000 0 mg/ml 5个浓度，8个复孔。另设调零孔。培养板于37℃，5%的CO2细胞培养箱中48 h，加入20 μl/孔增强型CCK-8溶液，其他以此类推。同时用加了相应量细胞培养液和增强型CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。在细胞培养箱里继续孵育0.5～4.0 h，分别在450 nm测定吸光度，分别取培养0.5 h、1.0 h、4.0 h分别用酶标仪检测，测得OD值。实验数据会因检测的仪器有所不同。

1.7流式细胞术(FCM)检测肝癌细胞凋亡 (1)取6孔板以 5×104个/ml的浓度接种细胞悬液，200 μl/孔，设对照组(PBS组)和苦参碱组，细胞贴壁后按分组加入药物，置培养箱孵育24 h后，胰酶消化成单细胞悬液，PBS 洗涤2遍，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，缓慢加入预冷的70%乙醇，4℃过夜。离心弃乙醇，PBS洗涤2遍，加入RNA酶，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶(PI)后4℃避光染色30 min。FCM分析各组的 DNA含量和细胞周期各时相的变化，实验重复3次。凋亡细胞为Annexin V标记阳性，PI染色阴性。(2)调整待测肝癌HepG2细胞浓度为5×104个/ml。取1 ml细胞，1 000 r/min、4℃离心10 min，弃上清。加入1 ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。1 000 r/min、4℃离心10 min，弃上清。对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS洗涤。将细胞重悬于200 μl结合缓冲液。加入10 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15 min或4℃反应30 min。加入300 μl结合缓冲液，再加入5 μl PI，即可上机检测。

1.8统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

环磷酰胺0.125 0、0.250 0 mg/ml时，苦参碱0.500 0、0.250 0 mg/ml时，对肝癌HepG2细胞抑制显著(P<0.05)，见表1。经过苦参碱处理后肝癌细胞凋亡明显增加，并且随着苦参碱浓度的增加细胞凋亡的比例也随之升高。见图1。

表1 不同浓度环磷酰胺、苦参碱对肝癌HepG2细胞的抑制作用

图1 流式细胞术检测肝癌细胞凋亡

3 讨 论

苦参碱对几种肿瘤细胞类型〔15〕，包括肝癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌有较为明显的抗肿瘤作用〔16～18〕。苦参碱通过抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡而显示出抗肿瘤作用〔19〕，同时有引发细胞凋亡蛋白酶依赖的独立程序细胞死亡的能力，显示出化疗的潜力。1995年苦参碱被中国食品药品监督管理局(CFDA)批准为非小细胞肺癌、肝癌的抗癌药物，并与其他抗癌药物配伍使用〔20〕，苦参碱因此也被已用于治疗肝病和保护肝功能，尤其是作为肝癌治疗的辅助药物。体内和体外研究表明，苦参碱剂量依赖性降低了HepG2细胞的存活率，增加了凋亡率〔21，22〕。苦参碱在细胞周期的G0/G1阶段明显抑制HepG2细胞，提示细胞周期进展迟缓可能是苦参碱抗增殖作用的机制之一〔23〕。不同浓度的苦参碱体外作用肝癌HepG2细胞株有抑制作用，苦参碱通过抑制线粒体自噬和PINK1/Parkin通路的新机制促进肝癌HepG2细胞凋亡〔24〕。