崔刚 张东东 韩雪 孙权

(1佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2保山中医药高等专科学校)

糖尿病心肌病(DCM)由Hamby等〔1〕于1974年首次提出，是一种糖尿病患者特殊的心肌病变，由糖尿病继发而来，且独立于冠心病和高血压之外，以心肌能量代谢或结构异常改变导致心肌细胞重塑，通过影响心肌细胞重塑最终引起心脏收缩舒张功能障碍〔2〕。DCM临床发病率高，危害大，现公认为常见和严重的糖尿病慢性并发症之一，成为现今研究的热点〔3，4〕。研究表明，沉积于心血管组织，由蛋白质和残留糖发生非酶化反应生成的糖基化终末产物(AGEs)在糖尿病心肌纤维化的发生发展中极其重要〔5〕。AGEs 可与其受体(RAGE)结合并激活一系列信号转导通路进而诱导成纤维细胞增殖〔6〕。作为免疫球蛋白超蛋白的一种细胞表面分子，RAGE与其他受体存在明显不同。一般受体会受到增加的配体水平的反馈性抑制，而RAGE 则会因为配体水平的升高增加其表达〔7〕。褪黑素(MT)属于吲哚类激素，由松果体分泌，对人类的睡眠、生殖及昼夜节律等起到调节作用，对机体的神经、内分泌和免疫系统均有影响。研究证实MT对糖尿病并发症具有良好的干预作用，并已试用于糖尿病肾病的治疗〔8〕。本研究探讨MT对DCM大鼠心脏的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1模型建立和分组 80只Wistar大鼠清洁级雄性(长春亿斯实验动物技术有限责任公司)，体重200～220 g，分笼饲养于佳木斯大学动物实验中心，自由摄食和饮水，每天光照12 h。随机分为正常组、模型组、MT低剂量组和MT高剂量组，每组20只，分笼饲养。除正常组外，其余3组都给予高脂高糖饮食4 w。大鼠禁食12 h，腹腔内(按50 mg/kg体重)注射1%链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)。给药后72 h尾静脉采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。实验时每4 w检测血糖一次。造模后每天10∶00至14∶00 MT(浙江延年褪黑素公司)灌胃一次，MT低剂量组剂量为10 mg/kg体重，MT高剂量组剂量为20 mg/kg体重，正常组和模型组同等剂量生理盐水灌胃。持续给药16 w。

1.2血糖值测定和计算心脏指数 给药前、后，测量前禁食、水12 h，尾静脉采血，血糖仪测量血糖值。分别检测大鼠空腹血糖。大鼠血流动力学指标检测之后，每组部分大鼠沿心底大血管根部剪下心脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干，精确称量心脏质量，心脏指数=心脏质量/体质量，称量后迅速将心脏放进-80℃冰箱冻存。

1.3心脏功能指标检测 10%水合氯醛0.03 ml/kg体重腹腔注射麻醉大鼠，固定在大鼠用手术台上，用弯剪剪去下颌骨至锁骨范围的毛。用1 ml注射器向右颈总动脉内注射500 U/kg体重肝素，并在生理记录仪的插管内注满肝素。依次切开皮肤、筋膜，暴露气管，用玻璃分针游离右侧颈总动脉，分离注意避免伤及神经。结扎右侧颈总动脉远心端，近心端留手术线备用，用动脉夹夹闭右颈总动脉近心端，靠近远心端剪一斜口(血管不剪断)，插入生理记录仪插管，动脉夹放开一下，血管充盈，将插管向心脏方向插入1 cm，用手术线扎好(松紧适宜)，放开动脉夹，将插管螺旋插入4～5 cm，观察生理记录仪读数，舒张压为0 mmHg即插入左心室。使用生理记录仪，测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张期末压(LVEDP)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、室内压最大下降速率(-dp/dtmax)和室内压上升达最大速率所需时间(t-dp/dt)等心功能指标。

1.4收集标本 断髓法处死实验大鼠，剪开胸骨，打开胸腔，暴露心脏。沿着心底大血管的根部剪断心脏，剖开右心耳，由左心室进针用200 ml左右生理盐水冲洗，当右心耳流出无色液体时可以停止冲洗，再用4%多聚甲醛溶液进行心脏固定，游离心脏放入10%中性甲醛溶液内浸泡后将组织制成5 μm厚石蜡切片。

1.5HE染色 ①脱蜡至水;②苏木素染色6 min，蒸馏水冲洗5 min;③1%盐酸-乙醇分化30 s，再次蒸馏水冲洗5 min;④伊红染色3 min，蒸馏水冲洗5 min;⑤脱水透明;⑥中性树胶封片;⑦显微镜下组织学观察并拍照。

1.6免疫组化染色 ①烤片30 min;②脱蜡脱水后将切片放入盛有Tris盐酸缓冲液(TBS)的抗原热修复盒中，放入微波炉中加热至煮沸，20 min后取出，自然冷却，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，各5 min;③5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，37℃，20 min;④一抗(RAGE浓度为1∶50，AGE浓度为1∶100)，4℃过夜;⑤复温至室温，PBS洗3次，各5 min;⑥试剂Ⅰ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min。试剂Ⅱ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min;⑦二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察，随时中断，蒸馏水洗3次，各3 min;⑧苏木素染色片刻，1%HCl-酒精分化30 s，蒸馏水洗3次，各5 min，自来水冲洗2 h(AGE染色时，省略此步);⑨脱水透明;⑩中性树胶进行封片;图像采集分析采用BI200软件。所得的IOD数值越大，AGE与RAGE蛋白的表达越差；数值越小，AGE与RAGE蛋白的表达越好。

1.7统计学处理 使用SPSS19.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1精神状态 正常组状态活泼，每日进食量和饮水量稳定，体重随周龄增加而平稳增加，眼睛有神发亮，行为动作反应快速，常出现打闹现象，皮毛光滑有光泽，鼠尾色泽红润，大、小便正常。模型组状态萎靡，每日进食量和饮水量增多、过频；体重增加随周龄增加而迟缓，有的甚至出现停滞；反应速度有些迟钝，出现抱团扎堆现象，皮毛暗淡不平顺、无光泽，眼神目光呆滞，鼠尾颜色发白，小便过频、大便时干时稀不规律。MT低剂量组和MT高剂量组精神状态尚可，每日进食量和饮水量趋于正常，体重增加缓慢，随周龄增长增加缓慢；日常活动略有增加，但动作略有迟缓；皮毛略有柔顺、光泽，眼睛发灰，略显呆滞，鼠尾毛色略有光泽，大便略稀，小便趋于正常。

2.2血糖、体重和心脏指数 MT处理16 w后，与正常组比较，模型组、MT低剂量组和MT高剂量组血糖和心脏指数明显升高(P<0.05)，模型组和MT低、高剂量组体重显著降低(P<0.05);与模型组比较，MT低剂量组和MT高剂量组血糖值略降低，心脏指数略升高，但无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组空腹血糖值、体重及心脏指数

2.3心脏功能 与正常组比较，模型组心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低、t-dp/dt升高，差异具有显著性(P<0.05)；MT低、高剂量组心功能LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、t-dp/dt差异不显著(P>0.05)；与模型组比较，MT低、高剂量组LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高、t-dp/dt降低，差异具有显著性(P<0.05)，MT低、高剂量组差异不显著(P>0.05)。见表2。

表2 各组心功能指标比较

2.4心肌HE染色结果 正常组心肌细胞体积正常，排列整齐，心肌各层均匀，结构清晰；胞质清澈，胞质颜色正常；心肌细胞核圆形或椭圆形，染色质分布均匀。模型组心肌细胞体积明显增大，排列紊乱、肿胀，心肌各层次不均，结构不清；胞质浑浊，胞质颜色变浅；细胞核呈长杆状，核固缩，核膜皱缩，出现双核，排列紊乱，染色质边聚于核膜下呈颗粒状。MT低剂量组和MT高剂量组心肌细胞体积略小，排列趋于整齐，心肌各层次结构和心肌细胞间隙略清晰可以辨认；胞质略有浑浊，颜色略浅，细胞核形态趋于正常的圆形或椭圆形，染色质均匀可见。MT低剂量组较MT高剂量组更明显(图1)。

图1 各组心肌HE染色(×400)

2.5心肌AGE和RAGE蛋白表达 AGE蛋白棕黄色阳性表达见于心肌细胞胞质或心肌细胞间质内，RAGE蛋白棕黄色阳性表达多见于心肌细胞膜上。处理16 w后，与模型组比较，MT低剂量组和MT高剂量组AGE、RAGE蛋白表达IOD值明显升高(P<0.05)；与正常组比较，MT低剂量组和MT高剂量组AGE和RAGE蛋白表达差异不显著(P>0.05)(表3和图2)。

表3 各组心肌组织中AGE和RAGE蛋白表达

图2 各组心肌中AGE、RAGE蛋白免疫组化(×400)

3 讨 论

生理状态下，人和哺乳动物血清中MT的含量随着昼夜交替，呈节律性的波动，其分泌量表现为，夜间比白天要高出5～10倍，正常情况下，凌晨2∶00～3∶00达到分泌量最高值。研究表明，MT对糖尿病大鼠血糖的影响有两种观点：①MT可以通过改善胰岛素抵抗程度〔10〕和调控胰岛β细胞胰岛素的分泌释放〔11，12〕，影响机体胰岛素的代谢，并能促进细胞对葡萄糖的利用，从而影响机体的血糖代谢，直接降低糖尿病大鼠血清中的血糖水平；②也有报道〔13〕显示MT对血糖水平没有影响，研究者认为这可能由实验过程中给药时间、给药方式和给药剂量不同等所致。

随着糖尿病进展，高血糖可导致心脏胶原沉积诱发心肌间质纤维化，还可提高AGEs含量，提高心肌硬度〔14〕。研究表明，STZ诱导的糖尿病大鼠8～12 w心肌细胞超微结构发生改变，6～14 w发生心功能下降〔15〕。本实验提示糖尿病大鼠心肌形态改变、收缩和舒张功能下降。而使用MT进行处理的糖尿病大鼠心肌形态得到明显改善，心功能各项指标也得到了很好的控制。

在糖尿病的微血管并发症中，RAGE信号通路扮演着重要角色〔16〕。AGE广泛存在于机体的血液及各种组织、细胞中，AGE作用广泛，通过两种途径发挥其生物学效应：①直接途径，直接修饰改变蛋白质、脂质和核酸等的空间结构和功能，造成机体损伤；②间接途径，AGE与特异性受体RAGE结合后，导致机体发生病理性改变，可激活多个细胞内信号转导通路，可诱导生成氧自由基及灭活一氧化氮(NO)等，参与不同类型细胞的氧化应激反应、炎性反应和血栓形成的过程〔17〕。高血糖状态下，蛋白质发生糖基化后，氧自由基生成也随之增加，并促进AGE形成，从而导致恶性循环〔16〕。AGE生成具有不可逆性，即使纠正了高血糖，AGE也不能降至正常水平，且可在组织中继续不断地累积。因此，AGE在DM并发症发生和发展全过程中起到重要作用。

RAGE广泛存在于人体各类细胞中，属于多配体受体，不仅参与内体炎症反应，还与糖尿病慢性并发症的发生、发展有关。RAGE与AGE结合后，激活相关信号反应，使内质网膜电位去极化和减少糖原合成酶激酶(GSK)-3β磷酸化，导致细胞功能障碍。糖尿病可以引起心房重构，扰乱心房内传导系统，是房颤的危险因素之一。AGE与RAGE的结合与DCM发生密切相关，阻断两者的结合可能会成为预防和治疗DCM的新靶点〔18，19〕。综上，MT可抑制糖尿病大鼠AGE和RAGE蛋白间的相互影响，从而减轻DCM时的心肌损伤程度，延缓病程。

致谢：黑龙江省北药与功能食品优势特色学科建设项目的支持。