王 旭，冯春明，孙述好，罗永成

( 1.辽东学院 农学院，辽宁 丹东 118003； 2.辽东学院 海岸带生物技术研究所，辽宁 丹东 118003； 3.丹东市渔业发展服务中心，辽宁 丹东 118000 )

水霉病具有高传染性、高发病率及高死亡率等特点，各种淡水成鱼、鱼苗和鱼卵都可发生，是淡水养殖鱼类的世界性病害[1-2]。该病病原为水霉属(Saprolegnia)真菌[3]。其中，寄生水霉(S.parasitica)是目前已发现的致病水霉中最为重要的病原菌，其孢子萌发快，侵袭能力强，几乎能够感染包括鲟鱼、鲫鱼(Carassiusauratus)、斑马鱼(Daniorerio)等在内的所有淡水鱼类及鱼卵[4-7]。孔雀石绿曾是治疗水霉病最有效的化学试剂，但因其强致畸、致癌及高残留等缺点，已被禁止使用。目前水霉病防治主要采用抗生素、杀菌剂、中草药、氧化剂等[8-14]。这些方法易造成水霉的耐药性，且存在效果不明显、成本高，使用受限，有效含量超出安全限量等问题[15]。研究表明，一些微生物来源的活性成分可以抑制真菌的生长和感染，且具有绿色、环保、安全、高效的优点[16-17]。笔者以寄生水霉为靶标菌，通过平板对峙培养，筛选对水霉生长具有抑制作用的菌株，并对其抑菌稳定性进行初步研究，以期为水霉病的生物防治提供优良菌种资源和基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4分离自辽宁省东港市淡水养殖池塘的散鳞镜鲤(Cyprinuscarpiovar.specularis)、彭泽鲫(Carassiusauratusvar.pengze)、大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)的发病组织及散鳞镜鲤鱼卵。经纯化、致病性测定和分子鉴定，确定其均为寄生水霉[18]。待筛选菌株为分离自丹东地区淡水养殖池塘周围土壤样品中的21株放线菌。所有菌株均保存于辽东学院农学院微生物工程实验室。

1.1.2 培养基

放线菌培养采用高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸钾1.0 g，氯化钠0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20.0 g，水1000 mL，pH 7.2。水霉培养和平板对峙试验采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、琼脂20.0 g、水1000 mL，自然pH。

1.1.3 拮抗菌基因组DNA提取及16S rRNA基因序列扩增试剂

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、Premix Taq Version 2.0(Loading dye mix)、DNA Marker(DL-2000)购自宝生物工程(大连)有限公司；引物1492R/27F(1492R：5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′，27F：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌筛选

采用平板对峙法进行初步筛选，用接种铲将1.1.1中纯化的寄生水霉接种于PDA平板中央进行活化，18 ℃培养3 d后，用直径0.6 cm的无菌打孔器制备菌饼，接种于PDA平板中央，18 ℃培养24 h后，采用十字交叉法，在距离靶标菌饼2 cm处对称点接待筛选菌株，以不接菌一侧为对照(图1)。置于18 ℃培养箱中培养，至对照一侧长满平板后测量抑菌带宽度，确定待筛菌株的抑菌效果。

采用发酵液抑菌试验确定其抑菌率，初筛所得拮抗菌株接种于装量40%的高氏一号液体培养基中，25 ℃发酵72 h。发酵液经细菌滤器过滤后，按照1∶5的比例与55 ℃的PDA培养基混合均匀，制备平板。冷却后，在平板中央接种寄生水霉菌饼，设无菌水为对照，每个处理3个平行，于18 ℃培养4 d后测量各处理的菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率/%=(d1-d2)/d1×100%

式中，d1为对照菌落生长直径，d2为处理菌落生长直径。

1.2.2 拮抗菌鉴定

拮抗菌形态特征测定参照文献[19-20]的方法进行。拮抗菌16S rRNA基因序列分析方法如下：将待测菌株接种在高氏一号平板培养基上，25 ℃培养3 d，用灭菌的枪头刮取适量菌体置于50 μL菌体裂解液Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR中，80 ℃水浴15 min，5000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板。选用通用引物27F:5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′和1492R：5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′进行16S rRNA基因序列扩增。扩增体系为：1×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL(1～10 ng)，引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 21 μL。PCR反应程序为：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30个循环；72 ℃，10 min，4 ℃终止反应。扩增产物经电泳检测后，由生工生物工程(上海)有限公司进行纯化、测序拼接。获得的基因序列在美国国立生物技术信息中心(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)进行Blast检测，下载同源性较高的菌种序列信息。利用软件MEGA X 10.0.2进行多重序列比对，并采用邻接法进行1000次步长计算，构建系统发育树。

1.2.3 拮抗菌传代稳定性测定

拮抗菌株于高氏一号培养基上传代培养，每48 h转接1次，连续传代10次，每个处理3个平行。平板对峙试验测定出发菌株与传代菌株对寄生水霉的抑菌效果，根据抑菌带宽度变化分析传代对拮抗菌抑菌效果的影响。

1.2.4 拮抗菌发酵液热稳定性测定

拮抗菌发酵采用高氏一号液体培养基，试验菌株菌液以5%的接种量接种于装量为40%的500 mL三角瓶中，30 ℃，120 r/min，培养72 h。发酵液采用无菌滤膜过滤，滤液4 ℃冷藏备用。

各取发酵滤液15 mL分别加入到20 mL直口离心管中，置于10、20、30、40、50、60、70 ℃下处理 2 h。之后按照1∶5的比例，将处理后的发酵滤液分别与灭菌后冷却至55 ℃的PDA培养基混合均匀制备平板。每个平板中央接种寄生水霉菌饼，每个处理3个平行，18 ℃培养至对照长满平板后，测量各处理菌落直径，计算抑菌率，检测不同温度处理对试验菌株发酵滤液抑菌活性的影响。

1.2.5 拮抗菌发酵液酸碱稳定性测定

拮抗菌无菌发酵滤液制备方法同1.2.4。各取发酵滤液15 mL分别加入到20 mL直口离心管中，用1 mol/L HCl和1mol/L NaOH分别调整pH至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，室温静置24 h后，将各管中的pH调回至未经处理的发酵滤液pH 6.8。之后按照1∶5的比例，将处理后的发酵滤液分别与灭菌后冷却至55 ℃的PDA培养基混合均匀制备平板。每个平板中央接种寄生水霉菌饼，不经处理的发酵滤液作为对照，每个处理3个平行，18 ℃培养至对照长满平板后，测量各处理菌落直径，计算抑菌率，检测不同pH处理对试验菌株发酵液抑菌活性的影响。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌筛选

平板对峙试验结果显示，菌株FX17对4株不同来源的寄生水霉菌株SMJ-1、SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4均表现出显著拮抗作用，其中抑菌带平均宽度最大为(25.40±0.13) mm(图1)。发酵液抑菌试验结果显示，菌株FX17的抑菌率达73.20%。

图1 菌株FX17对寄生水霉的拮抗作用

2.2 拮抗菌鉴定

2.2.1 拮抗菌FX17的形态特征

菌株FX17在高氏一号培养基上菌落微黄白色、干燥，培养基背面微黄色，气生菌丝微黄白色，基内菌丝无色，无色素(图2)。孢子丝多个螺旋形，孢子卵圆形、表面光滑(图3)。对照《放线菌的分类与鉴定》和《链霉菌鉴定手册》，菌株FX17的形态与链霉菌属(Streptomyces)特征一致。

图3 菌株 FX17的孢子丝

图2 菌株FX17的菌落形态

2.2.2 拮抗菌FX17的16S rRNA基因序列分析

以菌株FX17的基因组DNA为模板，1492R/27F为通用引物，经PCR扩增、测序获得长度为1443 bp的碱基序列(GenBank登录号：MN548370)。所测序列在美国国立生物技术信息中心数据库中进行Blast检索，结果显示，该菌株与链霉菌属细菌S.triostinicus的16S rRNA基因序列相似性为99.42%。选取并下载典型菌株序列，以小单孢菌属种类Micromonosporaviridifaciens为外群构建系统发育树(图4)，菌株FX17与S.triostinicus聚类在一个分支上，两者同源性达99%，显示出较近的亲缘关系，因此鉴定菌株FX17为S.triostinicus。

图4 基于菌株FX17的16S rRNA基因序列构建的系统发育树

2.3 拮抗菌FX17传代稳定性测定

拮抗菌S.triostinicusFX17和其传代菌株分别与寄生水霉进行平板对峙培养，结果显示，拮抗菌S.triostinicusFX17继代培养菌株与出发菌株之间抑菌效果差异不显著(P>0.05)(表1)，说明该拮抗菌抑菌效果传代稳定。

表1 拮抗菌S. triostinicus FX17及其继代培养菌株对寄生水霉的抑制作用

2.4 温度变化对拮抗菌FX17发酵液抑菌活性的影响

温度变化对拮抗菌S.triostinicusFX17发酵液抑菌稳定性的影响结果见图5，10～70 ℃内处理的样品其抑菌活性无显著性差异(P>0.05)，表明温度变化对拮抗菌S.triostinicusFX17发酵液中的抑菌物质的活性没有影响，该菌株发酵液中的抑菌物质对温度变化具有良好的耐受性。

图5 不同温度处理对拮抗菌S. triostinicus FX17发酵液抑菌活性的影响

2.5 拮抗菌FX17发酵液酸碱稳定性

pH变化对拮抗菌S.triostinicusFX17发酵液抑菌活性的影响结果见图6，试验菌株发酵滤液的抑菌活性对酸碱度变化较为敏感，pH低于6.0或高于8.0，抑菌率显著下降，仅在pH 6.0～8.0内抑菌活性较为稳定，表明拮抗菌S.triostinicusFX17发酵液中抑菌物质的活性受pH影响较大，在pH 6.0～8.0内抑菌作用稳定。

图6 不同pH处理对拮抗菌S. triostinicus FX17发酵液抑菌活性的影响

3 讨 论

3.1 水霉拮抗菌的筛选

以化学药物、抗生素、疫苗以及中草药等方法防治水霉病存在各自的缺点和不足。利用拮抗菌及其发酵产物对水霉病进行防治具有绿色、环保、安全、高效的优点，已成为水霉病防控研究的主流方向[4]。研究表明，一些细菌如芽孢杆菌(Bacillus)和放线菌(Actinomyces)对水霉菌具有良好的抑制作用。张书俊等[21]筛选获得1株对水霉菌菌丝体生长与孢子萌发具有明显抑制作用的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)LD038。贺凤等[22]从海底沉积物中分离、筛选水霉拮抗菌株海洋链霉菌(Streptomycessp.)S26，其产生的活性物质对病原水霉真菌有较强的抑制作用，并对外界环境变化有较强的适应能力。梁永增等[23-24]筛选的芽孢杆菌(Bacillussp.)JL04和短小芽孢杆菌(B.pumilus)JL50对水霉菌均具有显著抑制作用，且两株拮抗菌对鱼体没有毒性，传代稳定。笔者自实验室分离保存的21株放线菌中筛选获得一株对寄生水霉具有显著拮抗作用的链霉菌菌株FX17。试验结果表明，该菌株对不同来源的寄生水霉均显示出明显的抑制作用。经过对其形态学特征及16S rRNA基因序列系统发育分析可知，菌株FX17与S.triostinicus具有较近的亲缘关系。此前，S.triostinicus对寄生水霉的拮抗作用未见报道。

3.2 拮抗菌S. triostinicus FX17的抑菌稳定性及适应性

拮抗菌S.triostinicusFX17经传代培养后，对水霉菌拮抗作用稳定，表明其具有良好的传代稳定性。该菌发酵滤液经10～70 ℃低温及高温处理后，抑菌活性稳定，表明其发酵液抑菌活性成分能耐受高温，可以推测，拮抗菌S.triostinicusFX17所产生的抑菌物质为非蛋白类代谢物。这一结果与贺凤等[22]关于海洋链霉菌株S26的拮抗物质活性成分分析结果一致。淡水养殖水体的温度变化通常为0～34.6 ℃[25]，试验表明，拮抗菌S.triostinicusFX17发酵产物表现出对养殖环境温度变化的良好适应性。该菌的发酵产物抑菌活性对环境的pH波动较为敏感，仅在pH 6～8内具有显著的抑菌效果。通常，淡水养殖水体的pH变化为6.8～8.5[26]，可见该菌的发酵产物在淡水养殖水体中应用具有较好的酸碱适应性。

4 结 论

综上所述，拮抗菌S.triostinicusFX17在平板对峙试验及发酵液抑菌试验中均对水霉病常见病原菌寄生水霉具有显著拮抗作用，并表现出良好的传代稳定性。该菌株发酵液中的抑菌活性成分具有良好的热稳定性，推测为非蛋白类物质，且在淡水养殖水体的pH变化范围内抑菌活性稳定，表明拮抗菌S.triostinicusFX17所产生的抑菌物质具有开发成为水霉病生防制剂的潜在价值。