陈娇娇，鲁成银，王国庆，陈利燕，梁慧玲*，张颖彬*

（1.浙江农林大学农业与食品科学学院/浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，杭州311300；2.中国农业科学院茶叶研究所/农业农村部茶叶质量监督检验测试中心，杭州310008）

茶叶香气成分复杂多样，目前已知的茶叶香气成分超700种[1]。因此，找到能快速、全面、真实反映茶叶香气成分的提取方法尤为重要。传统的茶叶香气提取方法主要有同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction, SDE）和固相微萃取（solidphase micro-extraction,SPME）；目前，较新的提取方法包括搅拌子吸附萃取（stir bar sorptive extraction,SBSE）和Tenax TA 吸附。其中：SDE 法能蒸馏萃取香精油以进行定量分析，但长时间高温蒸煮会导致香气成分发生改变，同时，大量有机试剂的使用也会对环境产生危害[2]。SPME 法具有绿色环保、操作简单等[3-4]优点，已被广泛应用于茶叶香气成分分析中。而SBSE 法是将SPME 的吸附头改进为搅拌子，进一步增加了涂层的厚度，但两者的原理均为“相似相溶”[5]；与SPME 法相比，SBSE 法检测限低[6]，能提高吸附水溶液中半挥发性物质的准确度[7]，具有较好的应用前景。Tenax TA 吸附法是将Tenax TA材料填充至吸附管中，通过氮气吹扫试样使顶空带出的挥发性物质进入吸附管，属于动态吸附；该方法具有绿色环保、检测限低、真实反映样品香气组成[8]等优点，已广泛应用于大气污染物的检测中。

过去对茶叶香气的研究主要采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extraction,HS-SPME）法，近年来，顶空搅拌子吸附萃取（headspace stir bar sorptive extraction, HS-SBSE）法、SBSE 法和Tenax TA吸附技术逐渐被引入到茶叶香气分析中[9-11]。为了系统比较HS-SPME 法、HS-SBSE 法和Tenax TA法在茶叶香气分析中的特点与规律，本实验针对绿茶、黄茶、白茶3 类主要以清香为基础香型的茶类，以固相微萃取前处理条件为共同参数，结合气相色谱-质谱法对9个茶叶样品香气成分进行分析，进一步比较了3 种方法对茶叶香气总富集量、富集个数及富集结果中各类化合物相对含量的影响，旨在为筛选出更简单、快速，且能真实反映化合物组成的清香型茶叶香气富集方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

绿茶（龙井茶、径山茶、碧螺春、开化龙顶、安吉白茶）、白茶（白毫银针、白牡丹）、黄茶（莫干黄芽、蒙顶黄芽），通过感官审评确保样品具有该类茶叶典型的香气特征，实验样品均来自市售。

1.2 仪器与设备

PDMS TISTER搅拌磁子（德国Gerstel公司）；手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57348-U萃取头（美国Anapo有限公司）；JJ300型电子天平（江苏省常熟市双杰测试仪器厂）；HH-1 恒温水浴锅（江苏省杰瑞尔电器有限公司）；微池装置（英国Markes 公司）；包含Tenax TA 采样管、空玻璃管的热脱附系统TD100（英国Markes 公司）；7890B气相色谱仪和5977B质谱仪（美国Agilent公司）。

1.3 方法

在参照文献[12-13]的基础上，对固相微萃取的前处理条件（茶水比、平衡时间、萃取温度和吸附时间）加以改进；SBSE和Tenax TA方法的前处理条件与改进后的固相微萃取条件一致。

1.3.1 HS-SPME 方法

准确称取2.00 g 茶样，置于50 mL 萃取瓶中，并倒入6 mL 沸水，于60 ℃水浴锅中平衡10 min后，将提前老化1 h的萃取头插入萃取瓶中，顶空吸附60 min 后取出，再直接插入色谱进样器中解吸附5 min。每个样品重复3次。

1.3.2 HS-SBSE 方法

准确称取2.00 g茶样，置于50 mL萃取瓶中，并倒入6 mL沸水，于60 ℃水浴锅中平衡10 min后，插入提前老化1 h的搅拌子，顶空吸附60 min后取出，立即放入空玻璃管中，于TD100 系统中进行热脱附。每个样品重复3次。

1.3.3 Tenax TA 方法

准确称取2.00 g 茶样，置于特制的40 mL 玻璃皿中，并倒入6 mL沸水，于60 ℃微池中平衡10 min后，插入Tenax TA 吸附管并以30 mL/min 流速通入氮气，吸附60 min 后取出，放入TD100 系统中进行热脱附。每个样品重复3次。

1.3.4 热脱附条件

HS-SBSE热脱附条件：分流模式预吹扫1 min；280 ℃解析10 min；冷阱起始温度为－30 ℃，升温到300 ℃并解析5 min。

Tenax TA 热脱附条件：分流模式预吹扫5 min；一级热脱附为40 ℃解析5 min；二级热脱附为300 ℃解析10 min；冷阱起始温度为40 ℃，升温到300 ℃并解析5 min。

1.3.5 气相色谱条件

采用DB-Wax 毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm），进样口温度240 ℃，载气为氦气（纯度99.999%），柱流量1.5 mL/min，HS-SPME 为手动无分流进样，HS-SBSE 与Tenax TA 为自动无分流进样。升温程序：柱温起始温度50 ℃并保持5 min，然后以1.5 ℃/min 上升至170 ℃，再以10 ℃/min 上升至210 ℃并保持20 min，总时间为109 min。

1.3.6 质谱条件

电离方式为电子电离源（electron ionization,EI），离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV，扫描范围为质荷比（m/z）50～650。

1.3.7 定性与定量分析

根据气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS）联用分析得到的各色谱峰，通过计算机谱库NIST17 检索，同时结合化合物相对保留时间、NIST谱库及文献[14]中的保留指数和香气成分标准品进行定性；根据香气成分的峰面积采用面积归一化法得到各个香气成分的相对含量。

1.3.8 数据分析

采用SPSS 19.0软件对实验样品香气成分的相对含量进行单因素方差分析；采用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 3 种方法对不同类型香气化合物吸附数量的影响

表1比较了3种方法对醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、烯类、杂环类和含硫化合物8类香气化合物吸附种类及数量的影响。总体上，3种方法吸附9个茶样香气化合物总个数为HS-SBSE＞Tenax TA＞HS-SPME。

在同一个样品中，3种方法吸附同种类型香气化合物个数的结果（表1）显示：1）对于醇类，除龙井茶和蒙顶黄芽外，HS-SPME吸附的醇类化合物个数均低于或等于HS-SBSE 和Tenax TA，而用HS-SBSE方法萃取龙井茶、安吉白茶、径山茶和黄茶的醇类个数多于或等于Tenax TA，在其他茶样中均低于Tenax TA。2）所有样品中，Tenax TA吸附的醛类化合物个数最多，HS-SBSE吸附的多于或与HS-SPME相等。3）除龙井茶外，HS-SBSE吸附的酮类化合物数量多于或等于HS-SPME；除龙井茶和蒙顶黄芽外，HSSBSE吸附的酮类化合物数量多于或等于Tenax TA。4）酸类化合物仅在2 个白茶香气成分中出现，以HS-SBSE吸附的个数最多。5）白茶中HS-SPME吸附的酯类化合物最多，其他茶样中除碧螺春外，HSSBSE吸附个数最多。6）除径山茶和碧螺春外，HSSPME 萃取到的烯类化合物个数最多，所有茶样中Tenax TA吸附到的个数最少。7）除莫干黄芽和碧螺春外，HS-SPME 吸附的杂环类化合物最少，HSSBSE萃取安吉白茶、白毫银针、黄茶的杂环类化合物数量多于Tenax TA，而在径山茶、碧螺春、白牡丹中Tenax TA吸附的个数最多。

总之，不同方法对不同类型化合物的吸附能力不同，其中：HS-SPME对烯类化合物的吸附个数最多，对醛类化合物的吸附个数最少；Tenax TA 对含硫类和醛类化合物的吸附个数最多，对烯类化合物的吸附个数最少；HS-SBSE对醇类、酸类、酯类和杂环类化合物的吸附个数最多，对醛类化合物的吸附个数较少。

2.2 3 种方法对不同C 链长度香气化合物吸附数量的影响

3 种方法吸附的9 个茶叶香气成分在C1～C5、C6～C10、C11～C153个C链范围内的化合物数量如表2所示。总体上，对于C1～C5化合物，HS-SPME＜HSSBSE＜Tenax TA；对于C6～C10化合物，HS-SPME＜Tenax TA＜HS-SBSE；对于C11～C15化合物，Tenax TA 吸附到的化合物最少。此外，在3 个C 链范围内，C6～C10范围内的化合物个数最多。

表1 3种方法吸附9个茶样香气成分的个数Table 1 Number of aroma compounds for nine tea samples adsorbed by three methods

2.3 3种方法对不同茶样香气成分总吸附量的影响

由图1 可知：通过HS-SBSE 萃取的9 个茶样香气成分的总峰面积显著高于HS-SPME（P＜0.05）；除龙井茶外，Tenax TA吸附的其他茶样香气成分的总峰面积都显著高于HS-SBSE（P＜0.05）。

2.4 3 种方法对不同类型香气化合物相对吸附量的影响

3种方法吸附的9个茶样香气化合物的相对含量见图2，5个绿茶、2个白茶和2个黄茶的主要香气成分及其相对含量见附表1～3（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2019.09.191）。

对于含硫化合物，绿茶类的相对含量总体上高于黄茶和白茶类。含硫化合物主要是二甲基硫醚，属极易挥发且具有清香的物质。进一步分析每个茶样发现，Tenax TA吸附的龙井茶、径山茶香气成分中二甲基硫醚含量显著高于HS-SPME（P＜0.05）。

对于醇类化合物，1）5个绿茶中，除径山茶外，3种方法吸附的醇类相对含量有显著性差异。其中：HS-SPME、HS-SBSE 吸附的龙井茶香气成分中脱氢芳樟醇及香叶醇含量显著高于Tenax TA（P＜0.05）；Tenax TA 吸附的开化龙顶、安吉白茶中醇类香气成分3-己烯-1-醇相对含量显著高于HSSPME（P＜0.05）；HS-SBSE吸附的碧螺春香气成分中4，8-二甲基-3，7-壬二烯-2-醇相对含量显著低于HS-SPME 和Tenax TA（P＜0.05）。2）在白茶中，3种方法吸附的白毫银针和白牡丹醇类化合物相对含量的变化规律相同：HS-SPME吸附的这2个茶样中醇类相对含量（尤其是芳樟醇、香叶醇的相对含量）显著高于HS-SBSE 和Tenax TA（P＜0.05）；而HS-SBSE 吸附的白茶样醇类（如苯乙醇）的相对含量都显著高于Tenax TA（P＜0.05）。3）在黄茶中，HS-SPME吸附的醇类香气成分中芳樟醇及其氧化物的相对含量显著高于Tenax TA（P＜0.05），而HSSPME 与HS-SBSE 吸附的这些成分的相对含量无显著性差异（P＞0.05）。

表2 3 种方法吸附9 个茶样香气成分在3 个C 链范围内的个数Table 2 Number of aroma compounds in three carbon chain ranges for nine tea samples adsorbed by three methods

对于醛类化合物，Tenax TA吸附的醛类化合物的相对含量显著高于HS-SPME 和HS-SBSE（P＜0.05）。进一步分析发现，Tenax TA吸附的绿茶和黄茶中醛类含量较高的成分主要是2-甲基丁醛和3-甲基丁醛，白茶中是正己醛（P＜0.05）。

对于酮类化合物，除龙井茶、开化龙顶和蒙顶黄芽以外，HS-SPME、HS-SBSE吸附的其他茶样酮类化合物（尤其是紫罗酮和茉莉酮）的相对含量显著高于Tenax TA（P＜0.05）；HS-SBSE 吸附的碧螺春中酮类化合物（尤其是苯乙酮和紫罗酮）的相对含量显著高于另2种方法（P＜0.05）；Tenax TA吸附的龙井茶中2-丁酮和蒙顶黄芽中4-甲基-3-戊烯-2-酮的相对含量显著高于HS-SPME 和HS-SBSE（P＜0.05）。

对于酯类化合物，除碧螺春外，HS-SPME吸附的4 个绿茶中顺-己酸-3-己烯酯和反-丁酸-3-己烯酯相对含量显著高于另2种方法（P＜0.05）；水杨酸甲酯是白茶中重要的化合物之一，HS-SPME 吸附的白牡丹中水杨酸甲酯的相对含量显著高于Tenax TA（P＜0.05），但对于白毫银针，3种方法的差异不显著，推测由于水杨酸甲酯在白牡丹中的相对含量接近10%，HS-SPME 吸附时产生了较高的竞争效应，使得其含量比实际值更高；此外，HS-SBSE吸附的莫干黄芽中二甲基戊酸甲酯的相对含量较高，用其他2种方法均未分析到该物质。

对于烯类化合物，除碧螺春外，HS-SPME 吸附的龙井茶、径山茶、安吉白茶和莫干黄芽中烯类化合物相对含量和构成烯类的成分月桂烯和柠檬烯，开化龙顶中法尼烯以及蒙顶黄芽中杜松烯相对含量显著高于另2 种方法（P＜0.05）；HS-SBSE吸附的碧螺春中烯类化合物（如β-荜澄茄油烯、丁香烯）的相对含量显著高于HS-SPME 和Tenax TA（P＜0.05）。

对于杂环类化合物，除碧螺春和莫干黄芽外，HS-SBSE、Tenax TA 吸附的另7 个茶样中呋喃类和1-乙基-2-甲酰吡咯的相对含量显著高于HS-SPME（P＜0.05）。

图1 3种方法吸附9个茶样香气成分的总峰面积Fig.1 Total peak area of aroma compounds for nine tea samples adsorbed by three methods

2.5 3 种方法对不同C 链长度香气化合物相对吸附量的影响

3种方法吸附的9个茶样中不同C链长度化合物的相对含量见图3，5个绿茶、2个白茶和2个黄茶在不同C链长度范围内主要香气成分及其相对含量见附表1～3（http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2019.09.191）。

图2 3种方法吸附9个茶样香气成分的相对含量Fig.2 Relative content of aroma compounds for nine tea samples adsorbed by three methods

除HS-SPME吸附的龙井茶外，所有样品在3种吸附条件下均为C6～C10化合物的相对含量最高。除白茶外，3种方法吸附C6～C10化合物的相对含量均具有显著性差异（P＜0.05）：Tenax TA吸附开化龙顶、径山茶香气成分C6～C10的相对含量显著高于另2种方法（P＜0.05），而其吸附安吉白茶、莫干黄芽和蒙顶黄芽香气成分C6～C10的相对含量则显著低于另2种方法（P＜0.05）；HS-SBSE吸附龙井茶、开化龙顶、碧螺春香气成分C6～C10的相对含量显著高于HS-SPME（P＜0.05）。但3种方法分别吸附9个茶样香气成分C6～C10的总相对含量无显著性差异（P＜0.05）。

图3 3种方法吸附9个茶样中C链香气成分的相对含量Fig.3 Relative content of aroma compounds in three carbon chain ranges for nine tea samples adsorbed by three methods

3 种方法吸附9 个茶样香气成分C1～C5、C11～C15的相对含量均有差异：Tenax TA吸附的每个茶样香气成分C1～C5相对含量显著高于另2种方法（P＜0.05），HS-SPME和HS-SBSE吸附每个茶样香气成分C11～C15相对含量显著高于Tenax TA（P＜0.05），且HS-SPME 和HS-SBSE 吸附C1～C5的总相对含量显著低于Tenax TA（P＜0.05），但二者吸附C11～C15的总相对含量显著高于Tenax TA（P＜0.05）。因此，以下着重分析3 种方法吸附的茶样中C1～C5和C11～C15香气化合物中具有差异的成分。

进一步分析不同样品在C1～C5范围内产生显著差异的成分发现，龙井茶、开化龙顶、径山茶、碧螺春和白茶中二甲基硫醚（C2）、2-甲基丁醛（C5）、3-甲基丁醛（C5），安吉白茶和黄茶中1-戊烯-3-醇（C5）、顺-2-戊烯醇（C5）通过Tenax TA 吸附的相对含量显著高于HS-SPME和HS-SBSE（P＜0.05）。

对C11～C15化合物的分析结果表明：用HSSPME方法萃取龙井茶和开化龙顶香气成分时，顺-己酸-3-己烯酯（C12）相对含量显著高于另2种方法（P＜0.05）；HS-SPME和HS-SBSE吸附径山茶和安吉白茶的香气成分茉莉酮（C11）与异戊酸叶醇酯（C11），碧螺春、莫干黄芽和白茶的香气成分紫罗酮（C13）与茉莉酮，蒙顶黄芽香气成分杜松烯（C15）的含量显著高于Tenax TA（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 3 种吸附方法对香气成分总吸附量的影响

本研究在相同的茶水比、萃取温度、平衡时间和吸附时间条件下，比较了3 种吸附方法对9 个茶样香气成分的影响。结果表明：3 种方法的总吸附量排序为Tenax TA＞HS-SBSE＞HS-SPME，其中，Tenax TA通过填料进行动态全吸附，吸附体积远大于另2种方法，因此，该方法的总富集量在3种方法中最高。

SBSE 搅拌棒的发明主要改善了SPME 萃取头吸附量低、检测限高[15]等问题，本研究结果验证了SBSE 法的总吸附量高于SPME 的结论。通过计算本实验采用的SBSE 搅拌棒与SPME 萃取头涂层体积和总萃取量的倍数差，发现SBSE 的涂层体积约为SPME 的34 倍，但总萃取量仅为SPME 的1.46～2.69倍。可见，在相同的前处理条件下，仅有1 种聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）涂层的SBSE 吸附体积虽大于由二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS）3种涂层组成的SPME，但实际吸附茶叶香气总量的倍数远低于理论体积比。无独有偶，BICCHI等[16]在比较HSSPME与HS-SBSE萃取咖啡香气成分的实验中，所使用的SBSE涂层体积是SPME的110倍，富集量却仅为其5.24 倍。这种结果是由香气化合物在顶空瓶中被涂层反复吸附和脱附的竞争平衡效应导致的。

3.2 3 种吸附方法对香气成分相对含量的影响

茶叶的香气物质组成多样，香气化合物比例关系对香型的形成具有关键作用。因此，基于有效的吸附方法才能进一步分析并真实反映茶叶香气化合物构成。本研究中，3 种方法吸附的各个茶样中不同类型化合物的相对含量存在差别：用HSSPME 和HS-SBSE 吸附时醇类化合物中芳樟醇及其氧化物、脱氢芳樟醇、香叶醇，酯类化合物中顺-己酸-3-己烯酯和反-丁酸-3-己烯酯的相对含量高于Tenax TA 吸附。由于上述化合物均属于目前茶叶香气研究报道中含量较高的化合物，推测竞争效应的存在，增加了上述化合物在HS-SPME 和HSSBSE涂层上的相对吸附量。Tenax TA吸附的醛类化合物的相对含量显著多于HS-SPME 和HSSBSE，主要以短C 链的醛类化合物为主。理论上，Tenax TA对C6～C20化合物具有较好的保留能力，对C5及以下化合物的保留能力较差；而SPME与SBSE吸附的化合物范围是C3～C20，对短C链成分保留较好。但实际分析结果表明：Tenax TA 对短C 链化合物的富集能力高于HS-SPME 和HS-SBSE；HSSPME吸附的醇类、酮类、酯类、烯类物质中C10以上化合物的相对含量显著高于Tenax TA 吸附。这与SPME 和SBSE 涂层吸附时存在竞争效应而导致小分子化合物不易被吸附有关。LIEW 等[17]的实验结果也表明，HS-SPME 吸附化合物存在的竞争效应导致丁酸甲酯（C5）和己酸甲酯（C7）等较小分子的含量降低。考虑到短C 链化合物在Tenax TA 上仍然表现为不完全保留，因此，人实际闻到的香气成分中，短C 链化合物的含量可能更高。由于此类化合物具有极强的挥发性，在过去的研究中往往被忽视了。

4 结论

本实验对9个茶样（包括绿茶、黄茶与白茶，其总体熟化程度较低，具有清香、嫩香、花香等香气特征，其香气物质的构成具有一定的相似性）采用3种不同的吸附方法，比较其香气成分数量和相对含量间的差异，结果证实不同吸附方法会对茶叶香气分析结果产生影响：HS-SPME 和HS-SBSE 相对于传统的SDE 法具有便捷、无污染等优势，且HS-SBSE 由于增加了涂层厚度，相对于HS-SPME 具有更低的检出限，但由于竞争效应的存在，导致分析所得的化合物的相对含量和实际间存在一定差异，主要表现在短C链化合物相对含量的降低和部分长C链醇类及酯类化合物相对含量的增加。而Tenax TA吸附茶叶香气成分具有富集量更高且更能准确反映茶叶香气化合物组成等优点，通过Tenax TA吸附的短C链化合物的相对含量高于HS-SPME和HS-SBSE。