冼卓杰，池霖生，黄建洲，朱 莉，李小琴

(佛山市妇幼保健院，广东 佛山 528000)

1983年，Trounson和Mohry采用DMSO作为冷冻保护剂成功复苏了一枚人类胚胎，并移植后获得了妊娠。1999年～2005年，Kuwayama、Isachenko、El Danasouri、Lane等分别对人类卵母细胞、原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化冷冻方法进行了成功的尝试[1]，成为目前采用的各期配子和胚胎玻璃化冷冻方法的基础。目前玻璃化冻融方式较程序化冻融胚胎复苏率高[2]，但玻璃化冷冻实际中的冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)对胚胎有一定的毒性，胚胎长期保存后其安全性仍需进一步研究。笔者对行激素替代周期(HRT)冻融卵裂期胚胎移植的947个周期的资料进行回顾性分析，探讨冷冻胚胎保存时间对卵裂期胚胎的冻融复苏效果的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1研究对象：对2017年7月～2019年6月在我中心进行玻璃化冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)947个周期的资料进行回顾性分析，女方年龄20～44岁，平均(31.92±4.27)岁。入组标准：不孕原因为输卵管因素或男性因素，且女方卵巢储备功能正常，促排方案为长方案与超长方案所获的玻璃化冷冻胚胎，解冻移植周期内膜准备采取HRT方案。排除因素：患子宫内膜异位症与干扰胚胎着床疾病的患者；解冻胚胎移植周期失败超过2次的患者。根据卵裂期胚胎冷冻保存时间分为四组，冻存≤120 d(294个周期)为≤120 d组，冻存121～240 d(384个周期)为121～240 d组，冻存241～365 d(105个周期)为241～365 d组，冻存>365 d为>365 d组(164个周期)。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2研究方法：促排方案为长方案和超长方案，方案的选择，胚胎冷冻及解冻、胚胎移植等按照本中心的常规程序进行。胚胎玻璃化冷冻方法：冷冻试剂ES、VS室温平衡30 min后，将D3胚胎置于ES中平衡6 min，待其形态恢复后，在VS中冲洗数次，胚胎装入载杆，迅速投入液氮，胚胎在VS中的时间到投入液氮整个过程时间≤1 min。胚胎玻璃化解冻方法：解冻试剂包括WS1、WS2、WS3及WS4四种液体，提前30 min取出1 ml WS1倒入双凹皿中并置于无CO2、37℃培养箱中预温，其余三种液体分别置于室温下四孔板中复温。解冻时，快速将含胚胎载杆段浸入37℃的WS1中，轻晃使胚胎落下，37℃放置1 min，随后依次在WS2平衡3 min、在WS3中平衡5 min、在WS4平衡1 min，最后将胚胎转入6% CO2过夜平衡的G-2-PLUS培养液中进行胚胎评分后放置于37℃、6% CO2的培养箱中。移植前30 min将G-2-PLUS内的解冻胚胎转移至EmbryoGlue中。[3]

1.3胚胎评分标准[3]：本中心主要根据卵裂球数目、均一性及碎片率进行评分。记录卵裂球个数；均一性分3级(Ⅰ级：卵裂球大小均匀，形态规则；Ⅱ级：大小略不均匀，形态略不规则；Ⅲ级：大小明显不均，可有明显的形态不规则)；碎片分4级(Ⅰ级：无碎片或碎片数量<5%；Ⅱ级：碎片数量<20%；Ⅲ级：碎片数量为20%～50%；Ⅳ级：碎片数量>50%)。D3优质胚胎标准：D3胚胎细胞数为7～9个，细胞均一性为Ⅰ～Ⅱ级，碎片Ⅰ～Ⅱ级。

1.4HRT方案：月经第2～3天开始口服戊酸雌二醇4 mg，1次/d，口服5～7 d；月经第8～10天监测卵巢、子宫内膜厚度，增至口服戊酸雌二醇6 mg，1次/d，口服5～7 d。第13～15天监测子宫内膜厚度，如果内膜厚度<7 mm，雌激素以2 mg/d递增，直至B超监测下子宫内膜≥7 mm后，血雌二醇>367 pmol/ml(100 pg/ml)、血P<3.12 nmol/ml时，给予黄体酮40～80 mg/d肌内注射。开始注射黄体酮当日为第1天，第4天行卵裂期胚胎复苏移植术。胚胎移植后第14天查血HCG，确定是否妊娠。如阳性继续用HCG或黄体酮至妊娠10～12周左右，胚胎移植28～35 d后行B超检查，如妊娠囊中可探查到胎芽及搏动的胎心则为临床妊娠。

2 结果

2.1一般资料：四组患者各组之间女方年龄、解冻胚胎个数和平均移植胚胎个数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。>365 d组的女方年龄、解冻胚胎个数、平均移植胚胎个数均略高于其他三组。见表1。

表1 四组患者一般资料比较

2.2胚胎复苏质量比较：四组患者的卵裂期胚胎冷冻后，≤120 d组的解冻复苏率为97.64%，完整复苏率为95.79%，均略高于其余三组，但差异并无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 四组患者胚胎解冻复苏情况[例(%)]

2.3复苏胚胎移植后临床结局比较：四组患者解冻后移植的临床妊娠率、流产率、异位妊娠率和种植率差异均无统计学意义(P>0.05)，但>365 d组的临床妊娠率和种植率较低，≤120 d组与121～240 d组的流产率较高。见表3。

表3 四组患者解冻移植后的临床结局(%)

3 讨论

现在全世界范围内的生殖中心广泛采用胚胎和配子冷冻技术，使大量不育夫妇可以享受到天伦之乐。国内现在使用范围最广的冷冻方法当属玻璃化冷冻法。玻璃化冷冻技术有着应用范围广、复苏存活率高等优点，能够有效保存优质胚胎，提高每个促排卵周期的累积妊娠率，减轻患者经济与精神上的压力[4-5]。

有研究[6]表明, 解冻后胚胎质量对妊娠的成功率起主要作用，而冷冻的胚胎质量直接影响着解冻后的临床结局[7]。因此笔者回顾性分析了共947个冻融卵裂期胚胎解冻移植周期均通过长方案和超长方案进行促排，HRT方案进行解冻周期，尽量排除不同方案造成的差异。2010年Wirleitner B指出，胚胎冷冻时间的长短并不影响胚胎复苏后的存活率、着床率、妊娠率[8]。2014年我国的一项回顾性分析[9]得出相同的观点。本研究中四组的存活率、着床率和妊娠率之间差异无统计学意义(P>0.05)。Balaban B等指出,胚胎解冻后的复苏情况对妊娠率有着显著的影响[10]。本次研究中，>365 d组的解冻复苏率、完整复苏率和临床妊娠率均为四组中最低，一定程度上验证了前面的观点，但差异无统计学意义(P>0.05)。

虽然目前的大样本人群研究指出胚胎冷冻保存时间在6年内不会影响冻融胚胎的着床率、妊娠率及子代的出生缺陷率，但是今年来也有学者提出胚胎的冷冻保存可能会影响基因的稳定性，造成胚胎DNA碎片的增加、线粒体DNA的突变等[11]。尽管世界各地相继报道了许多长时间冷冻后，成功妊娠并分娩健康婴儿的案例，最长为冷冻胚胎保存了25年。但胚胎冷冻保存时间超过10年以上的活产均为个案报道，目前仍然缺乏大样本的研究。长期胚胎冷冻保存时间对FET子代安全性的影响尚不明确[12]。

综上所述，胚胎冷冻的时长不会影响冻融胚胎解冻的临床结局。但长期冷冻保存的胚胎对子代安全性的影响尚不明确。