李富琴，石永新，宋 晖

[中国科学院大学深圳医院(光明),广东 深圳 518106]

骨缺损的修复是临床上常见的治疗难题，由于受自体骨移植诸多并发症的限制，目前越来越多的学者将研究重点放在了骨支架材料的研发上[1]。良好的骨支架材料需要满足良好的生物相容性、骨诱导性、骨传导性，无致畸致癌，具有一定要求的机械性能及无不良反应等，其中最重要的特征是具有良好的生物相容性[2]。聚磷酸钙(calcium polyphosphate，CPP)是近年来发现的一种新型材料，具有良好的骨诱导性，优良的可控降解性及体内生物相容性等诸多优点[3]，成为骨修复材料的理想材料。淫羊藿苷(ICA)是目前常用的成骨诱导剂，近年来的研究成果肯定了ICA能够诱导间充质干细胞成骨分化,可用于骨组织工程中促进骨缺损的修复[4]。二者结合制成复合骨支架后，其生物相容性如何，尚未见报道。

1 材料与方法

1.1材料制备

1.1.1复合骨支架的制备：本次研究经过我院医学伦理委员会同意。CPP(聚磷酸钙,批号CAS10031-30-8,南京化学试剂股份有限公司)和ICA(淫羊藿苷, 批号YYH-120318,西安昊轩生物有限公司)。将Ca(H2PO4)2·H2O在500℃保温后再升温至熔融，淬冷后制得CPP非晶烧料，用无水乙醇清洗，烘箱烘干，研磨过筛,选取粒径范围为70～100 μm的CPP 非晶粉末用于实验烧料。将上述制得的CPP烧料放入电阻炉中二次烧结,再缓慢升温至580℃后保温一段时间, 然后冷却得到CPP 骨支架材料,按4∶1质量比例加入淫羊藿苷;选用25%柠檬酸+68%水+5%柠檬酸钠作为固化液；固液比例为3∶1，调制成糊，倒进直径10 mm、厚2 mm的自制模型，自然干燥后，脱模，得到所需CPP-ICA复合骨支架模块。将该复合骨支架用蒸馏水振荡并清洗10 min，高温高压(121℃，20 min)的条件下灭菌、烘干、备用。

复合骨支架大体观察外观白色，表面不光滑，整体呈均匀细小的蜂窝状空隙结构。电镜下见支架呈现结构均匀的蜂窝状结构，有支架小梁连接空隙结构，微孔结构成类圆形，孔径大小相对较均匀。支架的孔径约为110～160 μm，孔隙率为(71.69±0.86)%，孔隙密度为(0.24±0.07)g/cm3。支架具有良好的亲水性，吸水后复合骨支架均匀膨大，体积增加。经力学测试，CPP/ICA 复合骨支架具有良好的力学性能,可以满足实验用大白兔体内大段骨缺损移植的生物力学要求[5]。

1.1.2复合骨支架浸提液的制备:取备用的复合骨支架材料，浸提介质为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，按1 g∶10 ml比例，5%CO2,37℃培养箱中浸提24 h,离心后取上清液,过滤并除菌,保存在100 ml瓶中,在4℃保存，并在24 h内使用。

1.2方法

1.2.1成骨细胞MG63与CPP-ICA复合骨支架共同培养:取备用的复合骨支架，PBS反复冲洗3次，在DMEM培养液中浸泡1 d，置入24孔板，每孔1块，取MG63细胞悬液20 μl，浓度为1×106个/ml，接种在复合骨支架模块表面，每种模块设置6个复孔，置入5%CO2培养箱中37℃下孵育，4 h后，加入DMEM培养液2 ml，继续孵育后每24小时更换培养液，不同时间点观察细胞形态学改变，拍照记录。

1.2.2成骨细胞与CPP-ICA复合骨支架浸提液共同培养:以5×104细胞/ml的浓度制备细胞悬浮液，接种在一个有效孔96的孔板上，每孔100 μl，在5%CO2培养箱中37℃下培养24 h。定义实验组(骨骼材料骨提取物)、阳性对照组(6.4 g/L苯酚溶液)、阴性对照组(10%胎牛血清的DMEM培养液)，各组6个复孔，吸出原培养液，每孔加入100 μl，继续在培养箱培养，每24小时更换一次细胞悬浮液。观察和拍摄每组在不同时间点的细胞形态和细胞生长情况。CPP-ICA复合骨支架毒性的评估标准如下：①无细胞毒性：细胞贴壁附着好，形态为三角形或梭形，无异常形态；②轻度细胞毒性作用：细胞贴壁黏附好，部分细胞浓缩，少于1/3，偶尔有悬浮细胞；③中度细胞毒性作用：细胞贴壁黏附较差，细胞固缩超过1/3，有细胞悬浮；④重度细胞毒性作用：细胞不贴壁及生长，超过90%的细胞已悬浮死亡。

1.2.3细胞活性检测:用MTT法检测细胞活性。取5×104细胞/ ml的细胞悬液,接种于3块96有效孔板，每有效孔接种100 μl，在5%CO2培养箱37℃条件培养24 h后，设置6个复孔，并且抽吸培养物的原溶液，每孔100 μl。余孔继续在培养箱中培养，并在24 h、48 h、72 h更换悬液1次。在24 h、48 h和72 h后取出处理后的其中一块培养板，将MTT 20 μl添加到每个孔中，在5%CO2、37℃培养箱中培养4 h。吸出原始培养溶液，加入100 μl DMSO，将溶液振荡10 min。通过酶标仪测量吸光度A值，取平均值。 计算细胞增殖率RGR(%)，RGR=CPP-ICA复合骨支架浸提液A均值/阴性对照组A均值×100%。通过细胞毒性分类方法进行标记[2]，见表1。

表1 细胞毒性分类方法标记表

2 结果

2.1MG63与CPP-ICA复合骨支架共培养后细胞形态学观察:共培养第4天后，观察MG63细胞和CPP-ICA复合骨支架接触生长情况，见边缘均接良好，MG63细胞紧紧贴附复合骨支架边缘生长，细胞多呈梭形，形态正常。

2.2MG63细胞与CPP-ICA复合骨支架浸提液共培养后细胞形态学观察:在继续培养的第24小时,第48小时,第72小时，实验组的细胞贴壁生长良好,生长快，状态良好，数量逐步增加，细胞形态呈长梭形、三角形及多边形，其中以长梭形细胞居多，与阴性对照组细胞情况基本相似，而阳性对照组细胞形态异常，数量显著减少，细胞固缩，部分细胞逐渐崩解。见图1。

图1 图a、b、c分别为培养24 h、48 h、72 h后实验组细胞形态学改变图，如图可见细胞体积增大，胞浆丰富，数量迅速增长，形态呈梭形和多边形，细胞突起较前增多，细胞聚集成簇或融合成片

2.3各组MG63细胞生长和增殖情况比较:各组MG63细胞生长和增殖情况见表2及表3。

表2 不同时间点时各组细胞光吸收值(A值)比较

表3 不同时间点各组的RGR值及细胞毒性等级

由表2可见，培养24 h、48 h、72 h时，阴性对照组和实验组的A值无明显差异(P>0.05)；阳性对照组A值逐渐降低，培养24 h，阴性对照组和实验组A值高于阳性对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，在培养48 h及72 h时，阳性对照组A值均明显低于实验组和阴性对照组，差异有统计学意义(P=0.000)。由表3可见，在培养24 h、48 h、72 h时，实验组RGR值高于100%，细胞毒性等级为0级。

3 讨论

骨缺损是临床上常见的疾病，由于受自体供骨量有限及供骨区并发症等所限[6]，骨修复材料成为近年来研究的热点。骨组织支架工程目前被认为是治疗骨缺损这一世界性难题的首选方法[7]。骨支架需要满足良好的骨诱导性及传导性、生物相容性及足够的力学性能、可提供成骨细胞或直接成骨、形成良好的材料-骨组织界面等[8]。其中良好生物相容性是生物材料最基本的要求，细胞毒性为3～5级的材料为生物相容性不合格[2]。由于单一的骨修复材料很难同时满足以上要求，复合骨支架成为今年来研究的热点[9]。有学者将骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞等种子细胞与骨支架复合，经骨诱导后分化为成骨细胞，以增强骨支架的成骨性[10]。

本研究选用CPP作为骨支架，CPP是一种新型的可降解的骨修复材料[11]，CPP具有长链结构，在动物体内10 d便可逐渐降解分化，诱导骨质形成,且主链依靠大量P-O键的连接，类似于ATP中高能磷酸键[12]。P-O键降解断链可释放出能量供细胞活动，降解产物的成分为游离的钙离子、磷离子及可溶性磷酸盐、钙盐，无局部炎性反应。在组织工程研究常作为骨支架材料使用，在骨组织的缺损修复方面具有良好的应用前景[13]。ICA能够促进BMSCs的增殖及成骨分化。其具有来源广泛,提取工艺简单,获取便捷，费用低廉等优点,是一种很有应用前景的促进骨缺损修复的中药单体。近年来的研究显示，ICA能诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成骨细胞，抑制破骨细胞，从而促进骨缺损的修复[14-15]。毛勇等应用淫牟蕾昔与β-磷酸三钙复合后修复兔桡骨骨缺损，12周后骨缺损完全愈合[16]。李慕勤等实验发现羟基磷灰石-丝素蛋白/壳聚糖/淫羊藿具有更好地促进成骨细胞增殖的作用，其作为骨组织工程支架材料的可行性强[17]。宁兆荣等用脂肪干细胞复合载ICA-纳米羟基磷灰石支架材料对兔下颌骨缺损进行修复，12周后骨缺损修复良好[18]。本课题的设计基于以上思考，将CPP与ICA按比例混合后制成复合骨支架，CPP/ICA复合骨支架可以优势互补，期待用于骨缺损的修复。但是，该复合材料是否存在其他的化学反应或生化变化，而不能用于动物体内试验，本实验对其进行了体外生物相容性试验。

任何一种修复材料在应用于动物体内试验之前，首先应评价其生物相容性。只有具备良好生物相容性的骨支架，才能在体内进行试验。本实验中，MG63细胞在CPP/ICA复合骨支架上生长良好，呈梭状生长，随着培养时间的延长，出现片状生长。与CPP/ICA复合骨支架浸提液培养，细胞贴壁良好，细胞形态饱满，随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，与阳性对照组比较，差异有显著性，且细胞毒性等级为0，证实CPP/ICA复合骨支架具有良好的生物相容性，可用于动物体内试验，具有良好的使用前景。