张 希 廖宇娇 杨 卓 陈志敏 李文兵 胡昌江*

（1.成都中医药大学药学院， 四川成都611137； 2.成都市妇女儿童中心医院药学部， 四川成都611137；3.四川新绿色药业科技发展有限公司， 四川成都611930）

五子衍宗丸作为中医补肾益精的经典名方，临床上广泛用于治疗肾虚腰痛、遗精滑精、阳痿不育等症［1］，由枸杞子、炒菟丝子、覆盆子、蒸五味子、盐车前子组成。方中枸杞子、菟丝子共为君药，补肾益精，益阴扶阳；辅以覆盆子、五味子固肾涩精；佐以车前子利尿泄热［2］，诸药合用，具有补中有泻、涩中有利、补阴扶阳的配伍特点，主要用于男性阳痿不育、遗精早泄、生殖能力低下等症。

复方发挥疗效是多味药共同协作的结果，相比单味药来说，其治疗范围更广泛确切，但其所含成分也更复杂多样。因此，为了更加明确复方发挥疗效的物质基础成分并寻找到其集散群，就需要根据药物作用建立相应动物模型，将物质基础定位到某极性部位来进行研究。

本实验以NO、FSH、T 作为检测指标，筛选五子衍宗丸补肾涩精有效部位，建立其HPLC 特征图谱，采用灰关联度法研究它与补肾涩精药效之间的关联性［3⁃4］，以期为阐明该制剂物质基础提供理论依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子各10 批，均由四川新绿色药业科技发展股有限公司提供，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为正品。聚山梨酯⁃80 （成都市科龙化工试剂厂）；绿原酸 （批号110753⁃201415）、金丝桃苷（批号11521⁃201205）、槲皮素（批号100081⁃201610）、山柰酚（批号110861⁃201611） 对照品均由中国食品药品检定研究院提供。大鼠FSH （批号TWRYNAIQ）、T （批号 C0116080151 ）、NO （批号20180609） ELISA 试剂盒均由武汉赛维尔生物技术有限公司提供。乙腈、磷酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 动物 清洁级SD 大鼠，雄性，体质量180～220 g，由四川达硕动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（川） 2015⁃030。

1.3 仪器 Shimadzu LA⁃2040C 四元泵高效液相色谱仪（日本岛津株式会社）；KQ5200DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；控温冰箱（青岛海尔电冰箱生产厂）；JY20002 电子天平（0.01 g，上海方瑞仪器有限公司）；XPE26 电子天平（百万分之一，梅特勒⁃托利多仪器有限公司）；TG⁃16 离心机 （四川蜀科仪器有限公司）；DPD⁃700 电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；摩尔1810A 细胞型超纯水机（上海摩勒科学仪器有限公司）；RE⁃52A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 有效部位筛选

2.1.1 提取物制备 炒菟丝子、盐车前子、蒸五味子均按照2015 年版《中国药典》 方法炮制，采用醇水双提法以使其提取完全。按照《中国药典》 比例，取枸杞子20 g、炒菟丝子20 g、覆盆子10 g、盐车前子5 g、蒸五味子2.5 g，粉碎（过2 号筛），依次用6 倍量95%、70%、50%乙醇回流提取，每次1.5 h，合并滤液，作为醇提液；剩余药渣加入6 倍量水回流提取2 次，每次1 h，合并滤液，作为水提液，醇提液减压回收至无醇味后与水提液合并，浓缩得到药液浸膏，加入适量硅藻土拌干，依次用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、水索氏提取，即得［5］，挥干溶剂后加入5%吐温⁃80 助溶，再加水制成10 g／mL 相应溶液。

2.1.2 对大鼠NO、T、FSH 水平的影响 取SD 大鼠60只，随机分为正常组、模型组、石油醚组、乙酸乙酯组、水饱和正丁醇组、水部位组，每组10 只，除正常组外其他各组大鼠每天均灌胃给予20 mg／kg 雷公藤多苷溶液［6］，连续30 d。造模后4 h，除正常组、模型组外其他各组大鼠均灌胃给予“2.1.1” 项下相应提取物溶液（10 g／kg），正常组、模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水，连续30 d。

末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h，乙醚麻醉后腹动脉取血，4 000 r／min 离心15 min，取上层血清，-20 ℃下保存，检测卵泡刺激素 （FSH）、睾酮 （T）、一氧化氮（NO） 水平。通过SPSS 21.0 软件进行处理，计量资料以（） 表示，组间比较采用完全随机设计单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 为差异具有统计学意义，结果见表1。由此可知，与模型组比较，水饱和正丁醇提取物组NO、T 水平升高（P＜0.05），FSH 水平降低（P＜0.05）；与正常组比较，水饱和正丁醇提取物组三者水平均无明显变化（P＞0.05），故选择该部位作为有效部位。

表1 各提取物对大鼠NO、T、FSH 水平的影响（， n＝10）

表1 各提取物对大鼠NO、T、FSH 水平的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

2.2 HPLC 指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件 Wondasil⁃C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.2% 磷酸 （B），梯度洗脱（0～20 min，3%～7% A；20～25 min，7%～10% A；25～40 min，10%A；40～65 min，10%～15% A；65～100 min，15%～30% A；100～110 min，30% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。

2.2.2 供试品溶液制备 按“2.1.1” 项下方法制备各提取物后，精密称取水饱和正丁醇提取物适量，甲醇⁃氯仿（7 ∶3） 溶解（由于水饱和正丁醇部位极性大，单用甲醇不能完全溶解），定容至10.0 mL，制成10.46 g／L 溶液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 精密度试验 取同一批“2.2.2” 项下供试品溶液6 份，各精密吸取10 μL，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各色谱峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.3.2 重复性试验 取同一批“2.2.2” 项下供试品溶液6 份，各精密吸取10 μL，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各色谱峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.3.3 稳定性试验 取同一批“2.2.2” 项下供试品溶液6 份，各精密吸取10 μL，于0、2、6、12、24、48 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各色谱峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均小于3.0%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.2.4 指纹图谱生成 在“2.2.1” 项色谱条件下建立10批样品指纹图谱，见图1～2。共有20 个共有峰，其中7 号峰为绿原酸，11 号峰为鞣花酸，12 号峰为金丝桃苷，14号峰为槲皮素，18 号峰为山柰酚。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱

图2 对照指纹图谱

2.3 谱效关系研究 通过两序列曲线几何形状的相似程度来判断联系的紧密性，曲线越接近，相应序列之间的关联性越大，其大小用关联度来表示，用于判别因素对指标的影响程度［7⁃8］。

2.3.1 原始数据变换 采用均值化变换法，不仅消除了指标量纲和数量的影响，而且能更全面地反映原始数据中各指标变异程度和相互影响程度的信息，与中心化处理相比其所得结果更准确。本实验选择NO、FSH、T 水平作为母序列，各共有峰峰面积作为子序列，变换原始数据后得到均值化处理序列。

2.3.2 绝对差序列 经数据变换后的母序列记为 ｛X0（t） ｝，子序列记为｛Xi（t） ｝。在时间t＝k时（k为峰号），母序列记为｛X0（k） ｝，子序列记为｛Xi（k） ｝，两者绝对差序列Δ0i（k） ＝｜X0（k） -Xi（k） ｜（1≤i≤m）。

2.3.3 关联系数 取分辨系数ρ＝0.5 （ρ≤0.546 3 时分辨率最高，通常取0.5），计算公式为关联系数η（k） ＝（Δ0imin＋ρΔ0imax） ／ （Δ0i＋ρΔimax）。

2.3.4 关联度 参考文献［9］ 报道计算关联度r，公式为（n为子序列的数据数量），结果见表2。由此可知，对药效贡献较大（关联度＞0.6） 的共有峰有17 个，依次为7 号峰（绿原酸） ＞14 号峰（槲皮素） ＞16 号峰＞13 号峰＞15 号峰＞4 号峰＞3 号峰＞17 号峰＞9 号峰＞8 号峰＞18 号峰（山柰酚） ＞10 号峰＞6 号峰＞20 号峰＞5 号峰＞1 号峰＞19 号峰。

表2 HPLC 指纹图谱与补肾涩精药效的关联度

3 讨论

FSH 主要作用于睾丸的曲细精管上皮细胞，可通过诱导青春发育期睾丸间质细胞的成熟和增加间质细胞受体的数量，从而间接促进精子生成；T 是睾丸的主要内分泌产物，它作为经典的内分泌因子是精子发生的关键局部调节剂，两者共同促进睾丸曲细精管生长发育，促进精子发生和成熟［10⁃11］。NO 在男性生殖系统功能的调节中具有重要作用，它参与了精子发生、获能，并影响其质量，介导阴茎勃起、调节睾丸血供、激素分泌等，从而影响男性生育能力［12⁃14］。本实验发现，与正常组比较模型组大鼠的T、NO 水平显著下降，FSH 水平显著升高，经五子衍宗丸水饱和正丁醇部位干预后三者水平明显改善，表明该部位可促进生殖器官发育生长，维持睾丸生精调控。

本实验建立了五子衍宗丸水饱和正丁醇部位的HPLC指纹图谱，该方法简便，重复性良好。考察了乙腈⁃0.2%磷酸、乙腈⁃0.4%磷酸、［乙腈⁃甲醇（10 ∶1）］ ⁃0.4%磷酸、乙腈⁃0.1%甲酸流动相体系，发现乙腈⁃0.2%磷酸分离效果最佳；考察了3 种柱温，发现30 ℃时色谱峰分离效果较好；采用DAD 检测器考察了254、290、365 nm 检测波长，发现在254 nm 处色谱峰数量最多，分离效果最佳。

石油醚部位单用甲醇溶解时呈浑浊，不能完全溶解，放置后有沉淀析出，故又同时比较了石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、水部位的HPLC 指纹图谱。为了防止溶剂对指纹图谱的影响，本实验结合文献和样品性质，发现甲醇⁃氯仿（7 ∶3） 对各部位浸膏均能溶解。

灰色关联度是研究变量间相关关系的常用统计方法，可预测各成分与药效之间的关联性，对样本容量、数据分布规律的要求较低，容易程序化，而且在数据较少或分布不典型时结果更稳定［15］。通过对五子衍宗丸各提取部位的HPLC 指纹图谱进行比较后发现，主要有效化学成分群集中在水饱和正丁醇部位，色谱峰数量也最多，主要有效成分也能指认；乙酸乙酯部位药效也有一定的改善趋势，提取过程中也发现有较多有效成分溶出，虽然色谱峰数量与某些峰含有量比石油醚、水部位丰富，但与水饱和正丁醇部位相比还有较大差异。由此推测，五子衍宗丸有效成分集散群可能大多集中在乙酸乙酯、水饱和正丁醇部位的极性区间内。

综上所述，本实验初步揭示了五子衍宗丸补肾涩精有效部位的谱效关系，可为今后相关药效成分的定性鉴定和定量分析奠定基础，也为阐明其物质基础提供依据。