张 华 孟 博 王 莉 潘 婷 谢闰虎 朱文彬

（滁州学院材料与化学工程学院， 安徽滁州239000）

桑叶为桑科植物桑树Morus albaL.的干燥叶，具有祛风除湿、清肺润燥、平肝明目等功效［1⁃2］，现代研究表明，其主要活性成分为多糖、黄酮、生物碱、氨基酸、甾醇［3］。其中，多糖具有明显的降血糖、降血脂作用［4］，在开发药品、保健品等方面前景广阔。

关于桑叶多糖的提取，文献报道方法主要有热水浸提法、微波提取法、超声波提取法、酶解法［5⁃8］等。其中，超声波提取法利用超声波对溶剂的空化作用和次级效应，促进植物多糖浸出，但其热效应不强，需要较长时间才能达到足够高的提取温度；微波提取法利用微波能量加热植物细胞内部，使细胞内的活性成分更易释放［9⁃10］，将上述2种方法相结合时，具有提取率高、提取时间短、生物活性好的优点。目前，已有将两者联合应用于植物天然成分提取的报道［11⁃12］，但尚未涉及桑叶多糖。

因此，本实验采用超声⁃微波协同提取桑叶多糖，响应面法优化工艺，并考察该成分抗氧化活性，以期为其深入开发及相关产品研制提供理论依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 桑叶采自滁州学院，经滁州学院张伟钢副教授鉴定为正品。1，1⁃二苯基⁃2⁃三硝基苯肼（DPPH）、葡萄糖（纯度＞99.5%）、维生素C、无水乙醇、浓硫酸、苯酚均为国产分析纯。

1.2 仪器 SHZ⁃D （Ⅲ） 循环水式真空泵（巩义市宇翔仪器有限公司）；TU1810 紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；微波超声波组合萃取仪（上海比朗仪器制造有限公司）；BSM⁃120电子分析天平（上海卓精电子科技有限公司）。

2 方法

2.1 桑叶多糖提取 称取一定量桑叶，烘干粉碎后过60 目筛，石油醚脱脂，80% 乙醇除去色素，干燥，密封置于干燥器中，取适量按一定液料比加入蒸馏水后混合均匀，超声⁃微波协同浸提，抽滤，75%乙醇醇沉，离心，复溶，再进行二次醇沉，干燥至恒定质量，即得桑叶多糖。称取1.0 g，加蒸馏水定容至100 mL 作为样品溶液，备用。

2.2 桑叶多糖得率测定 采用苯酚⁃硫酸法［13⁃14］，在490 nm 波长处测定吸光度，以其为纵坐标（A），溶液质量浓度为横坐标（X） 进行回归，得方程为A＝2.151 5X＋0.001 17 （r＝0.998 2），在0.010～0.055 mg／mL 范围内线性关系良好。取1 mL 样品溶液于试管中，加入蒸馏水1 mL、5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，水浴反应15 min，在490 nm 波长处测定吸光度，代入上述回归方程测定溶液质量浓度，计算桑叶多糖得率，公式为得率＝n×c×V／m×100%，其中n为稀释倍数；c为溶液质量浓度，单位g／mL；V为提取物定容体积，单位mL；m为样品质量，单位g。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 吸取0.1 mg／mLD⁃无水葡萄糖对照品溶液0.5 mL，按“2.2” 项下方法平行测定6 次吸光度，测得其RSD 为1.86%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批桑叶多糖，按“2.1” 项下方法制备6 份样品溶液，按“2.2” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.29%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 按“2.1” 项下方法制备样品溶液，室温下于0、2、4、8、10、12 h 按“2.2” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.39%，表明样品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.4 加样回收率试验 吸取9 份“2.1” 项下样品溶液，按50%、100%、150%水平加入D⁃无水葡萄糖对照品溶液，平行3 份，按“2.2” 项下方法测定吸光度，测得其平均加样回收率分别为95.82%、97.62%、96.57%，RSD 分别为1.63%、1.21%、1.89%。

2.4 DPPH 清除率测定 参考文献［15］，称取1.0 g桑叶多糖，无水乙醇制成不同质量浓度溶液，各取1.0 mL，加0.1 mmol／L DPPH 乙醇溶液2.0 mL，室温下避光反应30 min，于517 nm 波长处测定吸光度Ai；以无水乙醇代替DPPH 乙醇溶液，测定吸光度Aj；以蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度A0，计算桑叶多糖对DPPH 自由基的清除率，公式为清除率＝ ｛ ［A0-（Ai-Aj）］ ／A0｝ ×100%。

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 液料比 在超声功率100 W、微波功率250 W、提取时间10 min 的条件下，考察液料比对多糖得率的影响，结果见图1。由此可知，液料比10 ∶1～25 ∶1 （mL／g） 时多糖得率逐渐升高，在25 ∶1 （mL／g） 时达到最大，之后略有下降，其原因可能是液料比升高时溶剂增多，传质速率变大，可促进多糖溶出，但溶剂过多容易造成超声波、微波的大部分能量作用于溶剂上，作用于物料上的减少［16］。因此，本实验选择20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL／g） 进行响应面优化。

图1 液料比对多糖得率的影响Fig.1 Effect of liquid⁃solid ratio on polysaccharides yield

3.1.2 超声功率 在液料比20 ∶1、微波功率250 W、提取时间10 min 的条件下，考察超声功率对多糖得率的影响，结果见图2。由此可知，超声功率50～150 W 时多糖得率逐渐升高，在150 W 时达到最大，但之后反而降低，其原因可能是超声波振动会产生较强的空化和剪切效应，使多糖传质效率提高，但振动过大可破坏其糖苷键［17］。因此，本实验选择100、150、200 W 进行响应面优化。

图2 超声功率对多糖得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield

3.1.3 微波功率 在液料比20 ∶1、超声功率100 W、提取时间10 min 的条件下，考察微波功率对多糖得率的影响，结果见图3。由此可知，随着微波功率升高，多糖得率先增后减，在250 W 时达到最大，其原因可能为微波功率升高可使温度快速上升，多糖溶出速度变大，溶出量增多，但功率过大可阻碍介质渗入［18］。因此，本实验选择150、200、250 W 进行响应面优化。

图3 微波功率对多糖得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on polysaccharides yield

3.1.4 协同时间 在液料比20 ∶1、超声功率100 W、微波功率250 W 的条件下，考察协同时间对多糖得率的影响，结果见图4。由此可知，多糖得率随着协同时间延长而升高，在15 min 时达到最大，但继续延长时反而下降，其原因可能为多糖结构和性质在较长时间的超声⁃微波作用下可降解为单糖［19⁃20］。因此，本实验选择10、15、20 min进行响应面优化。

3.2 响应面法优化 在单因素试验基础上，选择液料比（A）、超声功率（B）、微波功率（C）、协同时间（D） 作为影响因素，多糖得率（Y） 作为评价指标，响应面法［21］优化提取工艺。因素水平见表1，结果见表2。

图4 协同时间对多糖得率的影响Fig.4 Effect of synergistic time on polysaccharides yield

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results for tests

通过Design⁃Expertv8.0.6 软件进行拟合，得到二次回归方程为Y＝0.57＋0.100A-0.28B-0.062C-0.4D-0.28AB＋0.21AC＋0.28AD-0.11BC＋0.18BD-0.070CD-0.31A2-0.85B2-1.42C2-0.99D2，模型决定系数R2＝0.992 2，调整系数＝0.984 5，均接近于1，表明模型一致性良好；变异系数为3.06%，表明模型拟合程度理想，方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明它有显著意义；失拟项P＞0.05，表明失拟程度不显著；各因素影响程度依次为协同时间＞超声功率＞液料比＞微波功率，B、D、AB、AD、A2、B2、C2、D2有显著影响（P＜0.05，P＜0.01），表明该模型能用于预测。响应面分析见图5。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图5 各因素响应面图Fig.5 Response surface plots for various factors

通过Design⁃Expert8.0.6 软件进行拟合，得到最优工艺为液料比25.49 ∶1，超声功率139.3 W，微波功率250.19 W，协同时间13.82 min，桑叶多糖得率为5.264 6%，为了便于实际操作，将其修正为液料比25 ∶1，超声功率139 W，微波功率250 W，协同时间14 min。对上述优化工艺进行3批验证试验，测得桑叶多糖平均得率为5.19%，与预测值5.264 6%接近，表明模型稳定可靠。再将本实验所用的超声⁃微波协同提取与热水浸提［5］、微波提取［6］、超声提取［7］进行比较，结果见表4，可知该方法提取时间更短，多糖得率更高。

表4 4 种提取方法比较Tab.4 Comparison of four extraction methods

3.3 抗氧化活性研究 图6 显示，多糖溶液质量浓度与DPPH 自由基清除率呈正比，IC50为0.513 2 mg／mL，表明它具有较强的抗氧化活性。

图6 多糖对DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccha⁃rides on DPPH free radical

4 讨论

桑叶多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等组成［22］，具有明显的免疫调节、抗氧化、降血糖等作用。桑叶作为我国传统中药，具有安全性好、无不良反应的优点，而且资源丰富，在医药方面的应用越来越受到重视，多糖作为其主要活性成分之一，目前相关研究主要集中在单糖组成、糖苷键类型、分子极性，鲜有涉及提取工艺。本实验进行超声⁃微波协同提取桑叶多糖，该方法操作简单，提取时间短，多糖得率高，最优工艺为液料比25 ∶1，超声功率139 W，微波功率250 W，协同时间14 min，平均得率为5.19%。验证试验结果显示，该工艺合理可行，准确稳定，可为桑叶多糖的工业化生产提供参考。

现代研究表明，桑叶多糖能有效减少体内氧自由基及脂褐质［23］；本实验对该成分抗氧化活性进行评价，发现它具有明显的清除DPPH 自由基能力，IC50为0.513 2 mg／mL。由此可知，超声⁃微波协同提取的桑叶多糖具有较好的抗氧化活性，可为相关药物的研发提供参考。