张 培，陈 丹

（1. 河南省食品药品审评查验中心，河南 郑州 450008；2. 湖北省武汉食品化妆品检验所，湖北 武汉 430012）

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOF/MS）技术是软电离方式的质谱，具有快速、高灵敏度、高通量、耗用试剂较少及抗污染等优点，广泛应用于蛋白质组学、基因组学等生命科学领域［1-3］，已用于甘油三酯［4］、脂肪醇聚氧乙烯醚［5］等大分子的检测。传统基质自身的质谱碎片干扰小分子物质的检测，且MALDITOF/ MS 质谱信号重复性差，限制了其在小分子物质的定性定量检测的应用。随着新型基质和内标法的引入，MALDI-TOF/MS 技术的应用也逐步向小分子领域拓展［6-9］。孔雀石绿是一种有毒的三苯甲烷类有机小分子化合物，可用作治理鱼类、鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，且针对水产品水霉病有特效，常用于鲜活水产品贮运、流通环节［10］。孔雀石绿有潜在的致癌、致畸、致突变作用，有高度毒性、高残留等副作用［11］。美国食品药物管理局（FDA）未认可其在养殖业中的使用；我国在农业行业标准《NY 5071-2002 无公害食品鱼药使用准则》也将孔雀石绿列为禁用药物。目前，关于孔雀石绿的检测方法有酶联免疫法［12］、液相色谱法［13-14］、液相色谱质谱法［15-17］。免疫法简便快速，但定量准确度低，且有假阳性或假阴性风险；液相色谱法及液相色谱质谱法虽有较好的定量准确度，但前处理复杂，耗时较长，且需消耗大量有机试剂。本研究中采用MALDI-TOF/MS 快速定量孔雀石绿在养殖水中的含量，只需5 s 即可获得定量结果，探讨了MALDI-TOF/MS 在小分子快速定量方面有潜在的应用价值。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（德国Bruker公司）；涡旋混合器（美国Scientific Industries 公司）；MS104TS/02 型电子天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司，精度为万分之一）。

1.2 试药

α-氰基-4-羟基肉桂酸、2，5-二羟基苯甲酸、芥子酸（德国Bruker 公司）；石墨烯（南京先锋纳米材料有限公司）；丙酮、三氟乙酸（优级纯，国药集团化学试剂有 限 公 司）；D5-孔雀石绿（100 mg/L，批号为S039339），孔雀石绿（100 mg/L，批号为1ST7303），均购自美国First Standard 公司。

2 方法与结果

2.1 质谱条件

光源：氮激光；波长：337 nm；检测模式：线性阳离子；采集范围：20～1 000 Da。采用仪器配置的Data Explorer 4.0 软件对质谱图进行基线改正和默认平滑处理，根据所得峰高比值从标准曲线计算出运输暂养水中的孔雀石绿的残留量。

2.2 溶液制备

基质：按丙酮-水-三氟乙酸（85 ∶15 ∶1，V/ V/ V）配制Ta85 溶液，用涡旋机涡旋1 min，超声处理5 min，待用。取已配制好的Ta85 溶液作为溶剂，配制合适质量浓度的α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液。

供试液：精确吸取孔雀石绿标准品（100mg/L）1.0mL，置100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，得1.0 mg/L 标准中间溶液；精确吸取D5-孔雀石绿（100 mg/L）标准品1.0 mL，置100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，得1.0 mg/L 内标中间溶液。精确吸取标准中间溶液（1.0 mg/L），用水逐级稀释，配制成系列质量浓度（2.5，50，100，150，200 ng/mL）的标准工作溶液，同时加入内标中间溶液（1.0 mg/L），使内标工作溶液质量浓度均为50 ng/mL，临用临配。

样品：待测运输暂养水样经0.22 μm 有机滤膜过滤，加入D5-孔雀石绿同位素内标物，使每1 mL 样品溶液中含有内标物50 ng，涡旋混合1 min。将混合好的样品溶液与基质溶液各取200 μL，涡旋混合1 min，微量移液器精确移取2 μL 点在进样板的进样区域，进样板上的样品在常温下自然挥发结晶，上机测试。

2.3 方法学考察

线性范围、检测限与定量限考察：为了解决分析物与基质混合不均匀，分析物在进样板区域各位置分布不均匀造成的质谱信号不稳定、重复性差的问题，采用同位素稀释技术。精密吸取内标工作溶液适量，加入标准工作溶液中，使每1 mL 混合标准工作溶液中含有内标物50 ng。将配制的2.5，50，100，150，200 ng/mL 孔雀石绿工作溶液上机测定，以目标物和内标物的峰高比值为纵坐标（ Y）、孔雀石绿溶液浓度（ X）为横坐标绘制标准曲线。结果孔雀石绿质量浓度在2.5～200 ng / mL范围内与峰面积线性关系良好，线性方程为 Y =0.025 9 X +0.004 6，r2=0.998 8。在空白暂养水中添加不同质量浓度的孔雀石绿标准溶液，依法处理样品。信噪比（ S/ N）为3 时，孔雀石绿的检测限（LOD）为0.8 ng/mL；S/ N 为10 时，孔雀石绿的定量限（LOQ）为2.5 ng/mL。

加样回收试验：采用在空白运输暂养水中添加标准溶液的方法进行回收率试验，分别按低、中、高质量浓度（10，125，200 ng/mL）水平进行加样回收试验，平行测定6 次，计算回收率。结果见表1。

表1 阴性暂养水中孔雀石绿加样回收试验结果（n=6）

精密度试验：取孔雀石绿工作溶液（质量浓度为50 ng/mL）适量，按拟订检测条件连续进样6 次。结果的RSD 为0.53%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4 目标化合物含量测定

检测实验室抽检的流通领域的2 个多宝鱼、3 个黑鱼、2 个鳜鱼的运输暂养水，按本研究中已优化的条件进行检测，同时检测质控样品。结果显示，7 个运输暂养水中均未检出目标化合物，质控样品的回收率等指标均能达到药物残留分析要求，结果准确、可靠。

3 讨论

基质是MALDI 电离过程中必不可少的一种能量传递体，其主要作用是吸收激光的能量，并转移到样品分子上，使样品分子获得能量而电离。由于不同类型的样品电离所需能量不同，即不同样品需不同的基质。本研究中选择α-氰基-4-羟基肉桂酸、芥子酸、2，5-二羟基苯甲酸、氧化石墨烯作为基质考察孔雀石绿的电离效果。结果表明，基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸时，孔雀石绿的电离效果最佳，且基质的碎片离子均不干扰孔雀石绿的检测，因此选择α-氰基-4-羟基肉桂酸基质分析孔雀石绿。

不同质量浓度的基质导致样品电离程度也不同。质量浓度太低，样品所需能量不足，无法发生电离，信号太弱，无法测定目标物质；质量浓度太高，基质与样品会出现共结晶现象，形成许多干扰峰，使目标峰受到干扰，影响样品检测结果，也会使样品打得太碎，使目标物质发生不可预测的电离。本研究中选择1，1.4，1.8，2，3 mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液优化基质浓度。结果表明，α-氰基-4-羟基肉桂酸质量浓度为1.8 mg/mL时，孔雀石绿的响应度最高且不受基质干扰。故选择α-氰基-4-羟基肉桂酸质量浓度为1.8 mg/mL。

本研究中建立了应用MALDI-TOF/MS 技术快速定量检测运输暂养水中有机小分子孔雀石绿残留量的方法，其灵敏度、准确度与精密度均高，抗干扰能力强，适用于运输暂养水中孔雀石绿残留量的检测，且不需要前处理复杂样品，不使用流动相及色谱柱，一个样品可在5 s 内完成检测。

综上所述，MALDI-TOF/MS 在小分子分析检测领域有诸多优势，可为运输暂养水体中孔雀石绿残留量的风险评估提供一种快速、高效的分析手段，但现有辅助离子化的基质适用范围较窄，不能很好地满足其他小分子化合物的离子化需求，有待开发具有广谱适用性的小分子基质。