孙万里 鲁增辉 蔡华锋 周倩倩 马苑 王月

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一种常见非化脓性炎症性疾病，由结核分枝杆菌感染神经系统所致，TBM发病率占全身结核病的6%，是肺外结核中最为严重的一类，致残率、致死率高，严重危害患者生命安全[1]。TBM早期症状不明显，脑脊液常规、生化改变不典型，易造成误诊和漏诊[2]。颅脑CT、MRI检查特异性低，涂片检查耗时长、灵敏度低且漏诊率高[3]。因此寻找敏感、特异指标对TBM早期诊断非常重要，对及时治疗、改善患者预后意义重大。腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)是嘌呤代谢中重要酶类，与机体细胞免疫活性有关，结核分枝杆菌感染后，可引发机体免疫功能紊乱，释放ADA[4]。γ-干扰素(interferonγ，IFN-γ)是免疫反应中关键细胞因子，可促进细胞免疫应答，在TBM免疫反应中发挥重要作用[5]。近来体液中微小RNA(microRNA，miRNA)成为一种新型诊断标志物，有研究报道mir-155在结合分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中其重要作用[6]。结核性脑膜炎/利福平耐药基因检测(XpertMTB/RIF)是由美国Cepheid公司研发的一种新型TBM及利福平耐药诊断技术，目前在临床上备受关注[7]。因此本研究拟探究脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155联合XpertMTB/RIF检测在结核性脑膜炎诊断中的价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2019年1月本院收治的200例TBM患者为观察组，男103例，女97例；年龄18～75岁，平均年龄(42.75±11.58)岁。另取同期在本院进行脑脊液检查并经组织学、影像学技术确诊的非中枢系统疾病患者200例为对照组，男105例，女95例；年龄19～73岁，平均年龄(41.64±10.95)岁。2组患者性别比、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有样品采集及资料调查取得患者及其家属知情同意并签字确认，本研究经过本院道德伦理委员会批准通过，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合结核性脑膜炎的诊断标准[8]；②临床资料完整；③自愿配合调查研究。

1.2.2 排除标准：①细菌、真菌、病毒等引起中枢系统感染者；②患有恶性肿瘤者；③肝、肾等重要脏器功能障碍者；④临床资料不全者。

1.3 主要试剂及仪器 Trizol试剂(货号：R0016，上海碧云天)； PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)(编号：RR037A，TaKaRa)、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(编号：6210A，TaKaRa)；人ADA ELISA试剂盒(货号：货号 PA1-27246，美国Invitrogen)人IFN-γELISA试剂盒(货号：PT518，上海碧云天)；引物由广州锐博生物工程有限公司合成；紫外分光光度计(美国 Thermo Fisher公司)、RT-qPCR仪7500(美国Bio-Rad公司)等。

1.4 方法

1.4.1 脑脊液采集:无菌条件下，对受试者行腰椎穿刺，取脑脊液3 ml，3 000 r/min，有效离心半径10 cm，离心10 min，置于-80℃保存待检。

1.4.2 脑脊液细胞学检查:采用Olympus AV640 全自动生化仪检测脑脊液中白细胞计数、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞比例。

1.4.3 脑脊液生化指标检查:采用FCS IV型微型脑脊液细胞玻片离心沉淀器(Thermo Fisher，美国)检查脑脊液中糖、氯化物及蛋白质含量。

1.4.4 脑脊液ADA、IFN-γ水平检测:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑脊液ADA、IFN-γ水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.5 脑脊液mir-155水平检测:采用Trizol提取脑脊液总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度。反转录得到cDNA，置于-20℃保存备用。采用实时定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测mir-155表达水平。RT-qPCR采用20 μl反应体系：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye II(50×)0.4 μl ，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反应采用两步法，条件设置为：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40个循环；添加溶解曲线。mir-155上游引物(5’→3’)：ACACTCCAGCTGGGCTCCTACACATATT，mir-155下游引物(5’→3’)：CTCAACTGGTCGTGGA。内参U6上游引物(5’→3’)：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，U6下游引物(5’→3’)：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。采用2-ΔΔCT法对脑脊液中mir-155的相对表达水平进行定量分析。

2 结果

2.1 2组患者脑脊液细胞学检查结果比较 与对照组比较，观察组患者脑脊液中白细胞计数、中性粒细胞比例显著增加，淋巴细胞及单核细胞比例显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组脑脊液细胞学检查结果比较

2.2 2组患者脑脊液生化指标检查结果比较 与对照组比较，观察组患者脑脊液中糖、氯化物浓度显著降低，蛋白质浓度显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组患者脑脊液生化指标检查结果比较

2.3 2组患者脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比较 与对照组比较，观察组患者脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平比较

2.4 脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平单独检测及XpertMTB/RIF检测对TBM诊断价值比较 分别以脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平为检测变量绘制ROC曲线，结果显示脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平诊断TBM的AUC分别为0.824、0.827、0.785，灵敏度分别为81.00%、90.50%、74.00%，特异度分别为86.00%、77.00%、70.00%。以临床诊断为金标准，四格表分析显示，XpertMTB/RIF检出TBM的灵敏度为57.00%，特异度为91.00%。见表4，图1。

图1 ROC曲线脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平对TBM的诊断价值

表4 四格表分析XpertMTB/RIF对TBM的诊断价值 例

2.5 脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测对TBM诊断价值分析 将脑脊液ADA或IFN-γ或mir-155或XpertMTB/RIF检测TBM阳性规定为联合诊断阳性。脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF诊断TBM灵敏度为93.00%，特异度为91.00%。见表5。

表5 脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155联合XpertMTB/RIF检出TBM的四格表 例

3 讨论

生理情况下，中枢神经系统存在血-脑脊液屏障，脑脊液被封闭在蛛网膜下腔，机体血液中蛋白质、糖及氯化物等物质可选择性透过血-脑脊液屏障进入脑脊液[9]。机体感染结核分枝杆菌时，脑膜、脉络丛和室管膜会发生炎性反应，造成脑脊液生成增多，蛛网膜颗粒吸收下降，血-脑脊液屏障受损，通透性增加，血液中蛋白进入脑脊液增多，糖代谢发生紊乱，脑底处破裂结核结节周围包含大量多核型白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等物质的渗出物向蛛网膜下腔扩散[10]。本研究结果发现TBM患者脑脊液中白细胞计数、中性粒细胞比例显著增加，淋巴细胞及单核细胞比例显著减少，提示TBM患者存在白细胞和中性粒细胞、蛋白质显著增多，淋巴细胞、单核细胞、糖及氯化物减少症状，符合TBM诊断标准。

机体感染结核分枝杆菌后，在巨噬细胞抗原提呈作用下，通过T淋巴细胞产生免疫应答反应，释放IFN-γ，IL-2等大量淋巴因子，其中IFN-γ在结核分枝杆菌感染的免疫反应中起重要作用[2]。张燕等[11]研究发现，TBM患者脑脊液中IFN-γ水平显著增加。吴长静[2]研究发现，结核分枝杆菌感染患者诱导T细胞IFN-γ释放反应，导致脑脊液IFN-γ水平显著升高。ADA是腺嘌呤核苷酸代谢关键酶，可催化腺苷生成肌苷，经尿酸排出体外。结核分枝杆菌感染突破血-脑脊液屏障后，刺激中枢神经局部免疫系统T细胞增殖、分化，可导致脑脊液中ADA活性升高[12]。汤海燕等[9]研究报道，结合分枝杆菌感染可引起脑脊液中ADA水平增加。mir-155位于非编码转录体bic外显子，通过调节T细胞分化、参与炎症及免疫应答反应[13,14]。柴璐璐等[6]研究发现，miR-155-5p在TBM患者脑血浆中表达上调。本研究结果发现，TBM患者脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平均显著高于对照组。综合以上研究及本研究结果提示脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155可能是TBM相关敏感指标，TBM患者免疫应答反应中T细胞增殖分化可能导致脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平升高，但对TBM的诊断价值有待进一步研究。

王永峰等[15]研究报道，动态监测脑脊液ADA水平可作为评价TBM患者预后质量的重要指标。杨泽伟等[3]研究报道，脑脊液ADA、IFN-γ对TBM有一定诊断价值。Wu等[16]研究报道，mir-155在TBM患者脑脊液中表达水平升高，有潜力成为TBM敏感诊断标志。XpertMTB/RIF是一种新型TBM诊断技术，可同时检测TBM和利福平耐药。研究发现，XpertMTB/RIF对痰标本具有较高的灵敏度和特异度，对肺结核诊断价值较高，但对肺外结核诊断价值研究较少[17,18]。本研究分析发现脑脊液ADA水平诊断TBM灵敏度低，IFN-γ诊断TBM特异度低、mir-155水平及XpertMTB/RIF检测诊断TBM灵敏度和特异度均不佳。因此本研究进一步对脑脊液中ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF对TBM的诊断价值进行分析，结果发现，灵敏度为93.00%，特异度为91.00%，显著高于单独检测的灵敏度及特异度，提示脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测可提高对TBM诊断的灵敏度和特异度，对TBM诊断有一定临床价值。

综上所述，脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测可提高对TBM诊断的灵敏度和特异度，对TBM诊断有一定临床价值。但由于本研究样本量少，结果可能具有局限性，脑脊液ADA、IFN-γ、mir-155水平联合XpertMTB/RIF检测是否可应用于TBM临床诊断，尚需扩大样本量进一步验证。