唐亚芳 阎双缓 王晓静 陈勇良 戴二黑 李敏然

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个全球性的重大健康问题[1]。目前全世界范围内曾有约20亿人感染HBV，其中2.5亿人为慢性感染。而中国慢性HBV感染者约有7800万，每年死于HBV相关肝硬化、肝癌人数达30万[2,3]。HBV是一类嗜肝部分双链环状DNA病毒，HBV感染人体进入肝细胞后，部分双链环DNA在细胞核内延长正链后成为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。cccDNA是原始复制模板，用多种启动子能转录出多种mRNA，其中2.1 kb、2.4 kb的mRNA编码合成外膜大、中、主蛋白(hepatitis B surface antigen，HBsAg)，3.5 kb的前基因组(pg)RNA编码合成P蛋白、C蛋白(hepatitis B core antigen，HBcAg)和前C蛋白。前C蛋白经切割处理形成乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)。以pgRNA为模板反转录HBV DNA，然后组装各种HBV蛋白而成为完整的病毒颗粒，成熟的毒粒向细胞外分泌。因而，HBV感染人体后，外周血会出现大量的病毒颗粒。既往通过ELISA定性法可以检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb即乙肝五项血清标志物，以判断患者是否感染HBV及感染状态。近年来HBV血清标志物定量检测方法相继出现并在临床迅速推广应用[4]，因此本文将探索HBV血清标志物(HBsAg、HBcAb)定量检测与其他临床指标的相关性，分析其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究中的717例研究对象均为2012年1月至2018年3月在石家庄市第五医院门诊及住院就诊的慢性HBV感染者，其中男483例，女234例；年龄12～74岁，平均年龄(33.26±11.53)岁；病程1～32年，平均病程(15.34±8.02)年。所有患者符合我国2019年版慢性乙型肝炎防治指南[5]诊断标准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①HBsAg阳性至少6个月；②既往未接受保肝、抗病毒及免疫调节剂等治疗。

1.2.2 排除标准：①合并甲、丙、戊等其他嗜肝病毒感染；②人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus,HIV)感染者；③合并药物、酒精、中毒及其他因素引起的肝功能异常；④肝硬化或原发性肝癌；⑤妊娠、自身免疫性疾病、甲状腺疾病、癫痫等；⑥应用激素等免疫抑制剂治疗；⑦恶性肿瘤患者。

1.3 检测方法 受检者均在清晨空腹时经肘静脉采血，采用全自动血细胞分析仪(XN-1000，日本SYSMEX公司)检测白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HB)、血小板(PLT)。使用全自动酶免分析生化仪(Hitachi 7600，日本HITACHI公司)检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)生化学指标，ALT的正常上限值(upper normal limit,UNL)为40 U/L。血清HBV DNA定量检测采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测，检测仪器采用美国ABI公司ABI7300型PCR仪，试剂配套试剂，最低检测下限为500 U/ml。HBV血清学标志(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb)检测采用化学发光微粒子免疫测定方法，仪器为美国罗氏公司生产全自动免疫分析仪e601，试剂为配套试剂，HBsAg定量检测范围为0.05～130 000 U/ml。HBcAb定量检测采用郑州安图生物工程股份有限公司生产的HBcAb定量试剂盒。

2 结果

2.1 一般资料 717例初治慢性HBV感染者中，560例为HBeAg阳性感染者，157例为HBeAg阴性感染者。HBeAg阳性组患者年龄、病程显著低于HBeAg阴性者，差异均有统计学意义(P<0.05)。HBeAg阳性组患者血小板计数、HBV DNA水平及HBsAg滴度显著高于HBeAg阴性者，差异均有统计学意义(P<0.05)；但HBeAg阳性组患者TBIL与HBcAb定量水平显著低于HBeAg阴性者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 初治HBV慢性感染者临床基本特征

2.2 HBeAg阳性慢性HBV感染者血清HBsAg、HBcAb定量与其他指标相关性 HBeAg阳性慢性HBV感染者血清HBsAg水平与性别无相关性，与年龄、PLT、ALT、AST、TBIL及HBcAb(r=-0.16，P<0.001)呈弱相关，仅与HBV DNA呈中等相关。HBeAg阳性慢性HBV感染者血清HBcAb水平与年龄、性别无相关性，与PLT、TBIL、HBV DNA呈弱相关，与ALT、AST呈中等相关。见表2。

表2 HBeAg阳性初治HBV慢性感染者血清标志物定量与其他指标相关性

2.3 HBeAg阴性慢性HBV感染者血清HBsAg、HBcAb定量与其他指标相关性 HBeAg阴性慢性HBV感染者血清HBsAg水平与HBcAb(r=-0.06，P=0.45)无相关性，与年龄、性别、PLT、ALT、AST、TBIL及HBV DNA呈弱相关。HBeAg阴性慢性HBV感染者血清HBcAb水平与性别、TBIL无相关性，与年龄、PLT、HBV DNA呈弱相关，与ALT、AST呈中等相关。见表3。

表3 HBeAg阴性初治HBV慢性感染者血清标志物定量与其他指标相关性

2.4 慢性HBV感染者血清HBsAg定量与HBV DNA相关性分析 HBeAg阳性慢性HBV感染者血清HBsAg水平与HBV DNA呈正相关，即HBsAg水平随着HBV DNA升高而增加(r=0.42，P<0.001)，但HBeAg阴性慢性HBV感染者血清HBsAg水平与HBV DNA呈弱相关(r=0.14，P=0.08)。见图1。

图1 初治慢性HBV感染者血清HBsAg水平与HBV DNA相关性

2.5 慢性HBV感染者血清HBcAb定量与ALT相关性分析 慢性HBV感染者血清HBcAb水平随着ALT水平升高而逐渐升高。在HBeAg阳性者中，血清HBcAb定量与ALT呈中等正相关(r=0.36，P<0.001)，当ALT>120 U/L后，HBcAb水平不再显著升高；在HBeAg阴性者中，血清HBcAb定量与ALT亦呈中等正相关(r=0.37，P<0.001)，120 U/L0.05)。见表4，图2。

表4 初治HBV慢性感染者血清HBcAb定量与ALT相关性

HBeAg 阳性者 HBeAg 阴性者图2 初治慢性HBV感染者血清HBcAb水平与ALT相关性

3 讨论

我国目前慢性HBV感染者多为围生期或婴幼儿时期感染。围生期或婴幼儿时期感染HBV后，其慢性HBV感染的自然史根据自然病程一般可划分为4个期，即免疫耐受期(慢性HBV携带状态)、免疫清除期(HBeAg阳性CHB)、免疫控制期(非活动HBsAg携带状态)和再活动期(HBeAg阴性CHB)[5]。免疫耐受期患者：HBeAg阳性、HBV DNA高于2×107U/ml、ALT正常，肝脏无明显炎症坏死和纤维化；免疫清除期：HBeAg阳性、HBV DNA高于2×104U/ml、ALT持续或反复升高，肝脏有明显炎症坏死和(或)纤维化；免疫控制期：HBeAg阴性、HBV DNA低于2×103U/ml、ALT正常，肝脏无或仅有轻度炎症，可有不同程度纤维化；再活动期：HBeAg阴性、HBV DNA高于2×103U/ml、ALT持续或反复升高，肝脏有明显炎症坏死和(或)纤维化。

慢性HBV感染者可进展至肝硬化、肝癌，严重威胁人类健康。研究表明，未经治疗的慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B，CHB)在确诊之后，进展为肝炎肝硬化的5年累积发病率为8%～20%；未经治疗的代偿期肝炎肝硬化患者进展为失代偿期肝炎肝硬化的5年累积发病率约为20%；而未经治疗的失代偿期肝炎肝硬化患者预后极差，5年累积生存率只有14%～35%[6-8]。目前用于治疗CHB的抗病毒药物有干扰素和核苷(酸)类似物。有证据表明，长期有效的抗病毒治疗可以改善预后，延缓疾病进展，减少肝炎肝硬化、原发性肝癌的发生[6-10]。目前我国指南建议2019年版慢性乙型肝炎防治指南建议HBV DNA阳性的慢性HBV感染者，若其ALT持续异常且排除其他原因导致的ALT升高，均应考虑开始抗病毒治疗，即包括免疫清除期、再活动期患者。随着HBV血清标志物定量检测技术的开展，越来越多的研究显示HBV血清标志物定量水平可协助判断疾病进程、评估疾病进展风险及预测治疗效果等[9,10]。

HBsAg是HBV的外膜蛋白，是HBV感染的标志，在HBV感染者血液中以三种形式的颗粒存在：Dane颗粒、小球颗粒和管形颗粒，Dane颗粒内含部分双链环状DNA，是病毒复制的主体，后两者是空心颗粒，无感染性，但数目大量超过感染性Dane颗粒[11,12]。血清HBsAg是由具有转录活性的cccDNA及整合到肝细胞DNA转录成mRNA翻译产生，因此，我国2019年版慢性乙型肝炎防治指南建议慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者抗病毒治疗过程中HBsAg阴转后可考虑停止治疗，HBsAg阴转视为CHB患者功能性治愈的重要指标之一。本研究结果显示HBeAg阳性慢性HBV感染者血清HBsAg定量水平与HBV DNA呈正相关，但HBeAg阴性者血清HBsAg定量水平与HBV DNA无显著相关性。一项动物试验证实HBeAg阳性黑猩猩肝组织中病毒mRNA主要来源于cccDNA，而HBeAg阴性黑猩猩肝内90%以上病毒mRNA来自整合的HBV DNA，仅10%来自HBV cccDNA[13]。这可能是HBeAg阴性CHB患者血清HBsAg水平与HBV NDA缺乏相关性的主要原因之一。另有研究显示在慢性HBV感染自然史中，HBsAg定量在免疫耐受期最高，免疫清除期、免疫控制期逐渐下降，而再活动期会高于免疫控制期，与HBV DNA定量变化趋势一致[14]。Brunetto等[15]研究结果显示当慢性HBV感染者血清HBsAg<1 000 U/ml且HBV DNA<2 000 U/ml，预测免疫控制期患者诊断准确率达93.8%。CHB患者抗病毒治疗HBV DNA低于可检测值下限值后，多数患者HBsAg定量水平逐渐缓慢下降，少部分患者HBsAg无下降趋势[16]，究其原因亦可能与整合的HBV DNA相关。因此，应用核苷酸类似物或长效干扰素抗病毒过程中，治疗基线及初始阶段的HBsAg定量水平及下降速度可以预测血清学转换，包括HBeAg、HBsAg[17-19]。

HBcAg是病毒结构蛋白，参与HBV复制，同时具有极强的免疫原性，能够直接激活机体B细胞产生特异性HBcAb，极大多数感染者都产生HBcAb。由于HBcAb在细胞核内，外周血只能检测到HBcAb。HBV不直接损伤肝细胞，肝细胞病变主要是免疫应答反应引起的，机体的免疫应答在HBV感染的清除和致病机制中起至关重要的作用。机体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)识别感染HBV肝细胞表面的靶抗原后，经穿孔素途径诱导肝细胞坏死，破坏感染肝细胞同时清除病毒，细胞坏死肝细胞受损后会释放胞内ALT。本研究结果显示，慢性HBV感染者血清HBcAb定量水平与ALT呈正相关，随着ALT水平升高，HBcAb水平亦升高。但当ALT升高到一定程度后，HBcAb定量达到平台，不再随之升高。该结果提示，机体针对HBV的免疫应答机制颇为精细、复杂，当免疫应答过强后，免疫负调控有可能会发生作用。HBcAb与HBsAg产生机制不同，因此在慢性HBV感染中的自然史中变化趋势不同。HBcAb定量在免疫耐受期与免疫控制期显著低于免疫清除期与再活动期，同样，与ALT水平相关[20]。因机体免疫应答在HBV清除中起主导地位，应用长效干扰素抗病毒过程中，治疗基线及初始阶段的HBcAb定量水平及下降速度同样可以预测HBeAg的血清学转换[21,22]。

综上所述，本研究结果显示初治HBeAg阳性慢性HBV感染者血清HBsAg水平与HBV DNA呈正相关，HBeAg阴性慢性HBV感染者血清HBsAg水平与HBV DNA相关性则弱，而HBeAg阳性与阴性慢性HBV感染者血清HBcAb水平与ALT均呈正相关，两者区别应与其生物学特性相关。因此在临床工作中，监测慢性HBV感染者血清HBsAg、HBcAb定量变化可助于判断病情及指导制定治疗方案。