石斛属药用植物内生菌研究进展

2020-08-25韩洁杜琳霖赵杰宏

山地农业生物学报 2020年3期

韩洁杜琳霖赵杰宏

摘要：石斛作为名贵中药材具有重要的药用价值和巨大的开发潜力，随着市场需求量的不断增加，石斛资源已变得极其匮乏。石斛内生菌在石斛的生长发育、次生代谢和环境适应等方面有很强的促进作用，对石斛的产量和品质皆有较大影响，深入研究石斛内生菌及其与宿主的关系，对石斛生产有重要借鉴意义，因此综述了石斛属植物内生菌的多样性及其应用，并对其未来研究方向进行了展望。

关键词：药用植物;石斛;内生真菌;内生细菌;生物多样性

中图分类号：Q-9文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）03-0041-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.007

Progress on the Endophytes of Dendrobium Plant

HAN Jie， DU Linlin， ZHZO Jiehong.*

（Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Dendrobium is a valuable traditional Chinese medicine in China， which has great application and development potential. With the great increasing demand of market demand， Dendrobium resources are gradually scarce. According to research progress， it was found that the plant endophytes of Dendrobium had strong promoting effect on the plant growth， development， secondary metabolism， and environmental adaptation. As a result， the yield and quality of Dendrobium were affected by the endophytes. In this paper， the diversity and application of endophytes in Dendrobium were reviewed， and future research on endophytes was prospected.

Keywords：medicine plant; Dendrobium; endophytic fungi; endophytic bacteria; biodiversity

石斛属（Dendrobium）作为兰科中较大的属，我国有石斛属植物74个种，2个变种[1]，主要分布于云南、贵州、广西、广东、海南和台湾等省。石斛有非常高的医药和保健价值，是名贵中药材，位列“九大仙草”之首，在经济和药用上有很大的发展空间和潜力。近年来，石斛属药用植物已成为药食两用重点开发品种。《中华人民共和国药典》2010年版[2]和2015版[3]收载的石斛药材基原植物有金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum Lindl.）和流苏石斛（D. fimbriatum Hook. var.）的栽培品及其同属植物近似种，并且把铁皮石斛（D. officinale Kimura et Migo）单列。由于石斛生长的自然环境条件非常严苛，自然繁殖系数非常低，对人工栽培技术的要求很高，因此大面积推广和投入的风险较大。另外，近年来药材市场对石斛的需求不断上升，人们对天然石斛进行了无节制的采集，导致野生资源大幅度减少，有的石斛品种已处于濒危的边缘[4]。

内生菌作为一类生活在健康植物体内，而又不引起寄主植物明显病害症状的真菌、细菌和放线菌，它与植物在长期的进化过程中形成了互惠共生、相互依存的关系。在自然环境下，石斛内生菌对石斛具有促进其幼苗萌发、植物生长、增强抗性、诱导次生代谢产物合成等功能，是提高石斛生长速率和移栽成活率的关键。近年来发现流苏石斛β-谷甾醇、金钗石斛生物碱、红豆杉紫杉醇和馬比木薯蓣皂苷等药用活性成分[5-9]可通过分离其内生菌进行发酵生产，从而有望解决药用植物的资源稀缺、市场受限等关键问题。可见，石斛内生菌的深入研究将为石斛的研发和利用提供更多参考。本文就铁皮石斛、金钗石斛、霍山石斛和华石斛等石斛属植物在内生真菌和内生细菌的生物多样性、对宿主植物的影响及应用等方面的研究进行了综述。

1 铁皮石斛内生菌的多样性

铁皮石斛植物的内生菌种类繁多，真菌主要以瘤菌根菌（Epulorhiza）、链格孢（Rhizoctonia）、丝核菌（Rhizoctonia）等真菌为主。细菌主要以芽孢杆菌（Bacillus）、假氨基杆菌（Pseudaminobacter）等细菌为主。

1.1 铁皮石斛根部内生真菌

铁皮石斛内生真菌资源丰富，包括担子菌亚门、半知菌亚门和子囊菌亚门的57个属[10]。目前从铁皮石斛根、茎、叶中均已发现多种内生真菌，郭顺星等[11]在野生铁皮石斛根部分离得到内生真菌14株，分属于柱孢霉属（Cylindrocarpon sp.）、枝顶孢霉属（Acremonium sp.）、瘤菌根菌属、蚀丝霉属（Myceliophthoreae sp.）、头孢霉属（Cephalosporium sp.）、角菌根菌属（Ceratorhiza sp.）、简梗孢霉属（Chromosporium sp.）、丝核菌属、石斛小菇（Mycena dendrobii）、丛梗孢属（Moniliopsis sp.）;赵昕梅等[12]从野生铁皮石斛根部分离得到4株内生真菌，依据形态学特征和真菌18S rDNA ITS序列分析为镰刀菌属（Fusarium sp.）和柱孢霉属的菌株;帅红艳[13]从野生铁皮石斛根中分离得到 37 株内生真菌，分属于镰孢菌属、头孢霉属、拟小卵孢属（Ovulariopsis sp.）等，其中18株真菌具有一定的抗菌活性;毛益婷等[14]从铁皮石斛根中分离得到41株内生真菌，分属于毛壳菌属（chaetomium sp.）、旋孢腔菌属（Cochliobolus sp.）、间座壳属（Diaporthe sp.）等20个属，34个种;吴慧凤等[15]也从铁皮石斛根部组织中分离得到37株内生菌，其中9株为促生菌，rDNA ITS 序列分析显示，其中3株属于瘤菌根菌属、球座菌属（Guignardia sp.）。胡克兴等[16]从铁皮石斛根中分离到内生真菌28株涉及9个属。严亮等[17]从野生铁皮石斛根中分离出脉孢菌（Neurospora sp.）、索氏菌（Sordaria sp.）、青霉（Penicillium sp.）、德巴利酵母（Debaryomyces sp.）、毛壳菌、圆锥陷球壳（Trematosphaeria sp.）等真菌。不同学者分离的内生真菌种类和数量差异很大，可能和试验材料的生长土壤、品种来源、生长年限和采收期等因素不同有关。这些因素同样对石斛的化学成分和药材质量影响很大[18]，推测这种影响可能和内生菌的种群变化相关。

1.2 铁皮石斛茎叶部内生真菌

铁皮石斛茎和叶中的内生真菌也有一些报道。胡克兴等[16]从铁皮石斛茎中分离到内生真菌28株涉及13个属，叶中分离到内生真菌11株涉及7个属，其中不产孢真菌的ITS分子鉴定结果表明，其分别属于白粉寄生孢属（Ampelomyces sp.）、节菱孢属（Arthrinium sp.）等7个属。陈泽斌等[19]提取铁皮石斛叶中的DNA并进行PCR技术和高通量测序技术发现裸胞壳属（Emericella sp.）为云南普洱市野生铁皮石斛叶片中内生真菌的优势种群。李俊峰等[20]从野生铁皮石斛根、茎、叶中分离得到内生真菌22株，细菌9株，其中茎部内生菌分布最多。陈玉栋等[21]从人工培育的三年生铁皮石斛根、茎、叶中共分离得到 30 株内生真菌，根部有18株，3个属;茎部11株，6个属;叶部只分布了1个属，其中镰刀菌属和曲霉属（Aspergillus sp.）为优势菌种。以上报道说明铁皮石斛不同部位内生真菌的数量、分布和种群存有差异，这可能与内生真菌是逐步侵入，并具有部位或生化偏好性有关，但是较少见到关于内生真菌部位偏好性的报道，值得深入研究。

1.3 铁皮石斛内生细菌

对铁皮石斛内生菌的研究始于真菌，近年来对内生细菌也有较多研究，分离得到的细菌种类较为丰富，涵盖了厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和梭杆菌门的50个属[10]。张萍[22]从野生铁皮石斛根部分离得到19株内生细菌，其中6株为促生菌，包括芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）、腸杆菌属（Enterobacter sp.）、草螺菌属（Herbaspirillum sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）5个属;俞婕[23]从多地区采集的铁皮石斛根部和茎部分离出 134 株内生细菌，其中9株优势菌种为芽孢杆菌属细菌，有的具固氮酶活性。章华伟等[24]从野生铁皮石斛分离到内生细菌 23 株，分属于土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）、芽孢杆菌属、泛菌属（Pantoea sp.）、假单胞菌属（Pesudomonas sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）等。周小风等[25]结合传统分离法和 PCG-DGGE 法从温州产铁皮石斛根部分离得到12个属内生细菌，其中主要为芽孢杆菌属细菌;茎部分离得到6个属，其中主要为伯克氏菌属（Burkholderia sp.）细菌;叶部分离得到9个属，其中主要为假氨基杆菌（Pseudaminobacter sp.）细菌。周小风等[25]同时与人工种植的铁皮石斛相比，从野生资源分离的菌属里得到7个特有的菌属，分别为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）、泛菌属、草螺菌属、微杆菌属（Microbacterium sp.）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）。严亮等[17]从野生铁皮石斛中分离得到28株细菌，通过分子鉴定为10个属，芽孢杆菌属、土壤芽孢杆菌属（Solibacillus sp.）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus sp.）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）、短杆菌属（Brevibacteriumsp.）、短小杆菌属（Curtobacterium sp.）、节细菌属（Arthrobacter sp.）、链霉菌属（Streptomyces sp.）、伯克氏菌属、假单胞菌属。王明月等. [26]从人工种植的2年生铁皮石斛粉末中分离和纯化到49株内生细菌，其中荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescein）、环形芽孢杆菌（Bacillus annular）为优势菌种。可以看出，内生细菌的种类同内生真菌类似，也很丰富，但不同材料中的优势菌群相似性差，缺少整体上的关联分析，尚待深入揭示更多的生物学和生态学问题。

2 其他石斛内生菌的多样性

金钗石斛是《中国药典》中石斛药材指定的基源物种之一[2-3]。贵州赤水作为全国金钗石斛道地药材主产区，已受国家地理标志产品保护。郭顺星等[11]在金钗石斛无菌苗的根中分离到11种内生真菌，其中担子菌3种、半知菌5种、其余未鉴定。黎勇等[27]利用改良PDA-抗生素酸性培养基从金钗石斛根、茎和叶中分别分离出 2株、3株和1株内生真菌。廖晨阳等[28]从石斛假鳞茎和茎中获得一株能产生生物碱的石斛内生细菌，经鉴定为蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）。吴庆珊等[29]采用LB、NA、TB等9种培养基对3个不同地方的金钗石斛根、茎和叶的内生细菌进行了分离，共分离出1081株内生细菌，并采用扩增核糖体 DNA 限制性分析（ARDRA）法进行了多样性分析。可分为2门科2属40种1亚种，其中，芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属为优势菌。

霍山石斛是中国特有植物，目前已成为国家一级保护植物。闵长莉[30]等从霍山县采集霍山石斛将其根部用组织法分离，通过形态特征及分子生物学方法鉴定后得到内生真菌52株，其有5株内生真菌对金黄色葡萄球菌等指示菌株表现出拮抗活性。柴晓蕾[31]等从华石斛中分离出内生真菌179株，归类为25个属以上的类群，其中叶点霉（Phyllosticta sp.）为优势属，仅轮层炭壳属（Daldinia sp.）广泛存在于华石斛的根、茎、叶中，其余类群皆存在一定的组织偏好性，叶中分离的菌株数占比60.33%。

3 石斛内生菌对宿主生长发育的影响

植物内生菌在一定阶段或全阶段生存于植物体内，与植物形成了一种互利共生的关系。内生菌在兰科植物的生长过程中发挥了重要的作用。吴慧凤等[15]将湖南野生铁皮石斛中分离得到的11株非致病菌与铁皮石斛共培养，菌种促生效果显著。俞婕等[23]从铁皮石斛中分离的内生细菌ZJSH1 菌株能够促进组培苗生长，增加干重15.9%。赵昕梅等[12]把从野生铁皮石斛中分离的一种柱霉菌株液体发酵液喷洒铁皮石斛组培苗，成活率提高30.43%，植株高度增加31.21%，鲜重增加40.61%。董金海等[32]把从铁皮石斛分离的 NL-215 菌株与试管苗共生培养后发现该菌株有明显的促生作用，接菌苗的重量、株高、分株数、根数、新增叶数、总叶绿素量、多糖含量等都成倍增加。侯晓强等[33]从石斛中分离出8株内生真菌，能以菌丝或菌丝团的形式侵染铁皮石斛根被、外皮层和皮层，不侵染内皮层和中柱，区别于有害真菌。朱波等[34]从活树附生的铁皮石斛中分离到7株内生真菌，它们均能促进组培苗的生长，并提高了多糖含量。综上研究说明，有些内生菌对石斛的生长有一定的促进作用，且对内在品质也有一定的影响。是否还有一些不利的内生菌，却很少有人报道。

4 石斛内生菌的其他应用

何劲等[35-36]从石斛组织中分离到4株具有抗真菌活性的细菌，其中DFB-2菌株能强烈抑制多种植物病原菌、人体病原菌、植物内生菌和食品腐败菌，显示该菌在植物真菌病害的防治、抗真菌药物的筛选、食品防霉变和植物组培污染的防治上有一定的应用前景。朱江敏等[37]从石斛中分离获得的木霉菌能够抑制病原真菌镰刀菌，可应用于石斛的栽培管理，提高石斛抗病能力。廖晨阳等[28]从石斛假鳞茎中分离出的产生物碱内生菌，通过优化培养提高了石斛植物体次生代谢产物的含量。柴晓蕾等[31]研究结果表明华石斛部分内生真菌菌株具有较强抑菌生物活性。深入研发这些内生菌资源有可能用于生产杀菌剂。刘维[38]深入研究了铁皮石斛内生菌H1B1所产红色素的稳定性，认为药用植物内生菌有产生活性天然色素的潜力。闵长莉等[30]在霍山石斛内分离出的DH10菌株对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌能力，在抗菌药品上有潜在的研究价值。李俊峰等[20]从野生铁皮石斛中分离的内生真菌菌株TG2对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也有抑菌作用，同时TG2菌株代谢产物有较强的抗肿瘤活性。

5 总结与展望

兰科植物往往种子量很大，但种子萌发和生长发育等环节却离不开内生菌的共生，天麻就是其中的典型代表。近年来围绕石斛属植物内生菌的相关研究也逐步增加，但是大多集中在内生菌的菌种分离、形态和分子鉴定，以及促生作用研究方面，少数研究者筛选出了有抑菌、抑肿瘤作用的菌株。这大大丰富了石斛内生菌的研究领域，提高其应用价值，但是还需要更多的功能性菌种筛选和功能研究。尤其是通过协同进化，内生菌对石斛的次生代谢和药材道地性有何影响，如何影响，值得深入研究。

石斛属植物内生菌的种类比较丰富，在石斛的根、茎、叶中皆有分布，主要有真菌和细菌。内生真菌主要分属于担子菌亚门、子囊菌亚门和半知菌亚门的瘤菌根菌属、链格孢属、丝核菌属等。内生细菌主要以芽孢杆菌属、假氨基杆菌属等为主。围绕铁皮石斛内生菌的研究报道较多，而在金钗石斛、霍山石斛和华石斛的文献较少，在其他石斛上的研究更是少见。事实上，不同的石斛种，其生长发育、次生代谢和药理作用等方面有明显差异，如金钗石斛富含石斛碱，而铁皮石斛却富含石斛多糖，从而导致不同的功效和应用，因此需要加快更多石斛种内生菌研究，推动比较微生物组学分析和关联分析，发掘有益的内生菌菌群。

目前无论在石斛还是其他植物的内生菌研究上，大多采用了常规组织分离的方法，获得的内生菌是好氧型微生物，并且其中相当部分真菌菌株不产孢子，这导致很多资源难以鉴定和深入研究。因此，有必要开展内生真菌不产孢的形成机理研究，同时加强厌氧性内生菌的分离鉴定，拓展现有研究领域。另外，现有研究中菌种分离较多，共生机理研究较少。围绕内生菌对特定内生境的适应性进化，开展内生菌的形态发育、生理生化、遺传和代谢方面的研究，将为共生作用机制提供有意义的基础理论依据。总之，应充分利用现代生物技术，通过学科交叉，推动内生菌研究和应用的前沿探索与持续创新。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1999.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[4] 董丹丹，汪志平.石斛属植物内生菌的研究发展[J].药物分析杂志，2012，32（3）：550-553.

[5] 张禧庆.药用石斛内生真菌的分离鉴定及活性成分初步研究[D].贵阳：贵州大学，2008.

[6] 安忠琦.金钗石斛内生细菌的分离及抑菌活性研究[D].贵阳：贵州师范大学，2017.

[7] STIERLE A， STROBEL G， STIERLE D. Taxol and taxane production by taxus brevifolia， an endophytic fungus of pacific yew[J].Science，1993，260（9）：214-216.

[8] GANGADEVI V， MUTHUMARY J. A novel endophytic taxo-producing fungus chaetomella raphigera isolated from a medicinal plant， terminalia arguna[J].Applied biochemistry & biotechnology，2009，158（3）：675-684.

[9] 陈旭，雷帮星，文庭池，等.马比木植物内生真菌Trichoderma sp.抗癌活性产物的液体发酵工艺优化[J].山地农业生物学报，2015，34（5）：33-37.

[10] 龚莺，何伯伟，王淑珍，等.铁皮石斛内生菌研究进展[J].浙江农业科学，2017，58（8）：1372-1375.

[11] 郭顺星，曹文芩，高微微.铁皮石斛及金钗石斛菌根真菌的分离及其生物活性测定[J].中国中药杂志，2000，25（6）：338-341.

[12] 赵昕梅，远凌威，张苏锋，等.铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及其促宿主生长作用[J].河南农业科学，2012，41（6）：101-105.

[13] 帅红艳.广西环江产铁皮石斛内生真菌的分离鉴定及其生物活性的研究[D].南宁：广西大学，2008.

[14] 毛益婷，代晓宇，马荣.不同生境下野生铁皮石斛内生真菌多样性的初步研究[J].新疆农业大学学报，2011，34（3）：234-238.

[15] 吴慧凤，宋希强，胡美姣.铁皮石斛促生内生真菌的筛选与鉴定[J].西南林业大学学报，2011，31（5）：47-52.

[16] 胡克兴，侯晓强，郭顺星.铁皮石斛内生真菌分布[J].微生物学通报，2010，37（1）：37-42.

[17] 严亮，杨瑞娟，王桥美.云南铁皮石斛内生菌的分离与鉴定[J].云南农业大学学报，2015，30（5）：760-765.

[18] 蔡莉，许易梅，赵致，等.金钗石斛不同采收时间质量变化研究[J].山地农业生物学报，2019，38（1）：19-23.

[19] 陈泽斌，李冰，王定康，等.铁皮石斛叶片内生真菌多样性的研究[J].福建农业学报，2015，30（10）：978-983.

[20] 李俊峰，刘文洪，张贝贝，等.铁皮石斛内生菌的分离及代谢产物活性的初步研究[J].中医药杂志，2016，31（3）：970-974.