芝 佳，李东宁，郑 松，杨 阳，赵凤梅

1锦州医科大学附属第一医院 皮肤科，辽宁锦州 121001；2中国医科大学附属第一医院 皮肤科，辽宁沈阳 110001；3辽宁省健康产业集团抚矿总医院 皮肤科，辽宁抚顺 113008

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)是仅次于基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的第二常见的非黑色素皮肤肿瘤，转移率和死亡率均较高[1]，而Bowen病是一种表皮内的cSCC，约有5%患者的皮损可能发生侵袭性生长[2]。既往cSCC的治疗方法大多选用Mohs显微外科手术或标准手术切除，也可以应用放疗、化疗及进一步淋巴结切除手术。虽然手术切除是治疗的黄金标准，但广泛的局部破坏性或转移性病灶仍然是治疗的难题[3]。近年来，随着人们对肿瘤的发生、发展及肿瘤的免疫逃逸机制等方面研究的不断深入，肿瘤免疫疗法已有望成为肿瘤治疗领域的新方法，应用单克隆抗体阻断程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1)就是其中最有效的方法之一。目前，国内外关于PD-1和PD-L1在恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌及头颈部鳞癌等多种恶性肿瘤中的表达以及其拮抗剂的临床应用的相关报道很多，而关于cSCC的研究甚少，国内暂无相关报道。因此，本研究通过免疫组织化学方法观察PD-1和PD-L1在Bowen病及cSCC中表达，并分析其与肿瘤分化程度、浸润深度及其他临床病理特征的关系，进一步明确PD-1和PD-L1作为cSCC进展和预后的靶标分子，为免疫治疗cSCC提供理论依据。

材料和方法

1 研究对象 收集锦州医科大学附属第一医院、中国医科大学附属第一医院及辽宁省健康产业集团抚矿总医院于2016年6月- 2018年5月存档的病理诊断明确的患者皮肤活检标本蜡块。为防止日光及HPV病毒等因素的干扰，全部活检标本来自遮光部位及生殖器以外部位，且患者采集标本前均未经过放疗或化疗等治疗。通过筛选，共有49例Bowen病，47例高分化cSCC(Ⅰ级和Ⅱ级)及25例低分化cSCC(Ⅲ级和Ⅳ级)符合标准。cSCC分级参照Borders分级法：Ⅰ级，未分化细胞数＜25%；Ⅱ级，未分化细胞数25% ～ 50%；Ⅲ级，未分化细胞数50% ～ 75%；Ⅳ级，未分化细胞数≥75%。

2 实验分组 1)分为Bowen病组、高分化cSCC组和低分化cSCC组。2)为研究PD-1和PD-L1的表达与肿瘤浸润深度的关系，我们又将全部cSCC标本以小汗腺为界限(小汗腺位于真皮深层和皮下组织，由于所取标本部位不同及个体间差异，我们认为用相对固定的参考物衡量要比单纯用侵袭深度衡量更合适)进一步分为2组，即浸润深度未超越小汗腺水平(浅表cSCC)和浸润深度超越小汗腺水平(深部cSCC)。见表1。

3 主要实验试剂 兔抗人PD-1单克隆抗体(Abcam，ab137132)，兔抗人PD-L1单克隆抗体(Abcam，ab205921)，即用型S-P免疫组化试剂盒(福建迈新生物技术有限公司)，DAB试剂盒(北京中杉金桥公司)、苏木素(北京中杉金桥公司)、柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)(北京中杉金桥公司)。

4 样品采集及处理方法 切取4μm厚石蜡组织切片，贴于载玻片上，高温脱蜡后用0.01 mol/L柠檬酸修复液进行抗原修复，滴加氧化酶阻断溶液及血清封闭，室温孵育10 min。分别滴加PD-1抗体(1∶100稀释)及PD-L1抗体(1∶200稀释)，4℃湿盒过夜，次日室温复温1 h，复温后滴加生物素标记的二抗，室温孵育10 min，滴加链霉素抗生物素-过氧化酶溶液，室温下孵育10 min，DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，烤干，透明脱蜡，中性树胶封片。

5 实验判断标准 PD-1和PD-L1阳性染色定位于细胞膜。将染色后的切片置于显微镜下观察，在20倍物镜下随机选取5个视野，利用Image-pro Plus软件分析平均光密度值。

6 统计学处理 采用GraphPad Prism软件对资料进行统计学分析。计量资料以表示，组间平均光密度值比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PD-1在Bowen病、高分化cSCC及低分化cSCC中的表达 三组病人年龄、性别分布差异无统计学意义，见表1。PD-1表达于肿瘤浸润细胞而非肿瘤细胞。Bowen病组、高分化cSCC组与低分化cSCC组的平均光密度值分别为0.005 3±0.005 9、0.016 9±0.015 3、0.036 4±0.028 3。通过统计学分析发现PD-1在低分化cSCC组表达高于高分化cSCC组(t=-3.801，P＜0.001)，在高分化cSCC组表达高于Bowen病组(t=-4.941，P＜0.01)。见图1。

表1 患者分组情况及一般资料Tab. 1 General information of patients by grouping

2 PD-L1在Bowen病、高分化cSCC及低分化cSCC中的表达 PD-L1表达于肿瘤浸润细胞而非肿瘤细胞。Bowen病组、高分化cSCC组与低分化cSCC组的平均光密度值分别为0.002 9±0.003 4、0.010 0±0.009 4、0.038 8±0.0035 1。通过统计学分析发现，PD-L1在低分化cSCC组中表达高于高分化cSCC组(t=-5.294，P＜0.001)，在高分化cSCC组表达高于Bowen病组(t=-4.992，P＜0.001)。见图2。

3 肿瘤浸润深度不同的两组标本PD-1和PD-L1的表达情况 不同浸润深度的两组间比较差异无统计学意义，见表1。PD-1在浅表cSCC组和深部cSCC组的平均光密度值分别为0.020 0±0.017 5、0.026 8± 0.025 9；PD-L1在浅表cSCC组和深部cSCC组的平均光密度值分别为0.010 2±0.011 0、0.028 3±0.031 4。通过统计学分析发现PD-1和PD-L1在深部cSCC组标本表达均高于浅表cSCC组标本，PD-L1差异有统计学意义(t=-3.141，P＜0.01)，但PD-1差异无统计学意义(t=-1.326，P＞0.05)。见图 3。

图1 PD-1在Bowen病 (A)、高分化cSCC (B) 及低分化cSCC (C)中的表达(200×)及比较 (aP＜0.01， bP＜0.001)Fig. 1 Expression of PD-1 in Bowen's disease (A), highly differentiated cSCC (B) and poorly differentiated cSCC(C) (200×), and intergroup comparison (aP＜0.01, bP＜0.001)

图2 PD-L1在Bowen病 (A)、高分化cSCC (B) 及低分化cSCC(C) 标本中的表达(200×)及比较 (bP＜0.001)Fig. 2 Expression of PD-L1 in Bowen's disease (A), highly differentiated cSCC (B) and poorly differentiated cSCC(C) (200×), and intergroup comparison (bP＜0.001)

表2 B ow en 病与cS CC 组织PD1 a -1/P D-L1ic op 表达与患临床理数的关系ow Ta b. 2 R elationship b etween expression of P D-1/PD -L nd clin atholo 者gical p 病aram 参eters in B en 's d isease a nd cS CC Characteristics Bowen's disease cSCC n PD -1 expression t P PD -L 1 expression t P n PD -1 expression t PD -L 1 expression t Gender 0.657 0.515-0.231 0.819-1.521 P0.133-1.572 P0.120 Male 36 0.00 5 0±0.006 2 0.002 7±0.0 01 41 0.020 2±0.017 1 0.01 5 0±0.0 17 Female 13 0.00 6 2±0.005 0 0.002 9±0.0 03 98 31 0.028 3±0.027 9 0.02 4 5±0.0 33 92 Age 0.504 0.617-1.515 0.136 0.791 0.432-1.557 0.124＜65 yrs 23 0.00 4 9±0.007 1 0.003 6±0.0 03 28 0.021 0±0.020 2 0.02 5 0±0.0 34≥65 yrs 26 0.00 5 7±0.004 6 0.002 2±0.0 02 89 44 0.025 4±0.024 0 0.01 5 3±0.0 17 58 Race 1.099 0.277-0.212 0.833-1.289 0.221 0.822 0.425 Han 41 0.00 5 7±0.006 7 0.002 8±0.0 03 61 0.021 1±0.020 0 0.02 0 3±0.0 26 Minority 8 0.00 3 2±0.001 7 0.003 1±0.0 04 30 11 0.031 3±0.024 8 0.01 3 4±0.0 25 41 Location 0.898 0.374-0.146 0.885-1.600 0.117 0.407 0.962 Trun k 37 0.00 5 7±0.006 6 0.002 8±0.0 03 3 43 0.019 2±0.017 0 0.01 9 3±0.0 25 1 Limbs 12 0.00 4 0±0.002 4 0.003 0±0.0 03 7 29 0.027 8±0.025 2 0.01 9 0±0.0 28 1 Disease course-1.479 0.146-1.400 0.168-1.498 0.139-1.530 0.130＜5 yrs 29 0.00 6 3±0.006 9 0.003 1±0.0 03 3 45 0.026 7±0.025 2 0.02 2 7±0.0 29 9≥5 yrs 20 0.00 3 9±0.003 7 0.002 0±0.0 01 7 27 0.018 6±0.016 5 0.01 3 1±0.0 15 9 Tumor size-1.255 0.216-1.892 0.065 0.644 0.522 0.097 0.923＜2 cm 19 0.00 4 0±0.004 0 0.001 8±0.0 01 3 30 0.021 6±0.017 5 0.01 8 7±0.0 23 3≥2 cm 30 0.00 6 1±0.006 7 0.003 6±0.0 04 0 42 0.025 1±0.025 7 0.01 9 3±0.0 27 8 Tumor invasion-1.326 0.189-3.141 0.002 Superficial 39 0.020 0±0.017 5 0.01 0 2±0.0 11 0 Deeper 33 0.026 8±0.025 9 0.02 8 3±0.0 31 4 Differentiation-3.801＜0.001-5.294＜0.001 Highly 47 0.016 9±0.015 3 0.01 0 0±0.0 09 Poorly 25 0.036 4±0.028 3 0.03 8 8±0.0 03 45 Metastasis----No 72 0.023 7±0.025 9 0.01 9 1±0.0 25 9 Yes 0--

4 Bowen病及cSCC组织PD-1和PD-L1表达与患者临床病理参数的关系 Bowen病组织PD-1和PD-L1表达与患者性别、年龄、种族、肿瘤部位、病程和肿瘤直径无关(P均＞0.05)。cSCC组织PD-1和PD-L1表达与患者性别、年龄、种族、肿瘤部位、病程和肿瘤直径无关(P均＞0.05)，与肿瘤的分化程度有关(P＜0.001)；PD-L1表达与肿瘤的浸润深度有关(P＜0.01)。见表2。

图3 PD-1和PD-L1在浅表cSCC和深部cSCC标本的表达(n.s.，无统计学差异； aP＜0.01)Fig. 3 Expression of PD-1 and PD-L1 in superficial cSCC and deeper cSCC (n.s., not signi fi cant; aP＜0.01)

讨 论

已有研究证实，PD-1和PD-L1表达于多种恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈部鳞癌、Merkel细胞癌以及淋巴瘤等[4-15]。在非小细胞肺癌及头颈部鳞状细胞癌中，PD-L1的表达与肿瘤的分化程度有关，而PD-L1的高表达与预后不良有关[7-8]。在肺腺癌肿瘤细胞中，PD-L1的表达与某些癌基因的组织学形态、等级和表达有关[9]。组织学上，PD-L1的肿瘤表达通常只出现在免疫反应活跃的区域[10]。在cSCC中，Slater和Googe[16]研究发现，PD-L1在20例低风险肿瘤中，有4例阳性表达(20%)；而在20例高风险肿瘤中(直径≥2 cm，组织学评分≥2，和/或肿瘤厚度≥4 mm)，PD-L1有14例阳性表达(70%)；在5个转移鳞癌中，PD-L1全部阳性表达(100%)，因此认为无论在低风险或高风险cSCC中，都可显示PD-L1的表达，并且PD-L1的表达程度与肿瘤的分化程度呈负相关，与转移风险呈正相关。

肿瘤浸润细胞是指肿瘤微环境中的细胞成分，包括肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤浸润树突状细胞、肿瘤相关成纤维细胞等。在肾癌组织中，PD-1在肿瘤浸润细胞表面的高表达介导了肿瘤的免疫逃逸及患者的不良预后[11]。另有研究发现PD-1在恶性黑色素瘤患者的外周血和肿瘤组织中的肿瘤浸润细胞表面呈高表达，引起效应性T淋巴细胞的耗竭和功能障碍，并拮抗肿瘤免疫反应[12]。乳腺癌中PD-1在肿瘤浸润细胞的大量表达与患者生存时间较短相关[13]。在宫颈癌和肝癌中，有近半数的肿瘤浸润CD8+T细胞表达PD-1，其与肿瘤细胞表达的PD-L1结合后，可能导致细胞毒性T淋巴细胞的耗尽及凋亡[14-15]。但目前关于PD-1在cSCC中的表达方式罕有报道。

我们的研究中，PD-1和PD-L1在Bowen病、高分化cSCC及低分化cSCC肿瘤浸润细胞中均有不同程度的表达，通过统计学分析发现PD-1和PD-L1在低分化cSCC表达最高，其次是高分化cSCC，再次是Bowen病，在深部cSCC表达高于浅表cSCC组，结论与Slater和Googe[16]的研究结果基本一致。PD-1和PD-L1在有侵袭性的cSCC中高表达，为PD-1/PD-L1抑制剂的肿瘤免疫治疗奠定了基础。PD-1在深部cSCC组标本表达高于浅表cSCC组标本，虽然无统计学差异，但这也可能与统计样本量不足有关，具体原因还有待于进一步观察证实。

PD-1/PD-L1抑制剂是针对PD-1/PD-L1通路的抗体蛋白，可以此为靶点赋予免疫细胞更强的杀伤活性，实现肿瘤的精准治疗。近年来，抗PD-1/PD-L1药物治疗研究在多种恶性肿瘤中开展，目前通过美国FDA认证的PD-1抑制剂的药物有纳武单抗(Nivolumab)和帕姆单抗(Pembrolizumab)，PD-L1抑制剂有阿特珠单抗(Atezolizumab)[17]，另外还有多种药物正在进行临床试验中，暂未上市。并且Nivolumab也于2018年6月15日获国家药品监督局批准国内上市。随着肿瘤免疫逃逸机制研究的深入，以及多项临床试验的开展，人们发现运用单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1信号通路已成为一种新的肿瘤免疫治疗手段，其在恶性黑色素瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头颈部鳞癌以及淋巴瘤等多种类型肿瘤的治疗过程中均表现出显著疗效[18-20]。Degache等[21]报道了2例Pembrolizumab治疗的巨大性难治性cSCC病例，均获得了比较好的疗效，而且没有出现明显的毒性作用。其中1例左侧颈椎区的9 cm×8 cm大小的肿瘤，给予Pembrolizumab单抗2 mg/kg，每3周注射一次，3次注射后证实肿瘤减到2 cm×2.5 cm。PD-1/PD-L1抑制剂的药物临床研究已获得阶段性成果，并从单药研究深入到联合用药研究，根据肿瘤微环境的免疫状态不同，其效果也存在差异。在耐药机制、肿瘤标志物检测等方面的研究也在逐渐完善。

综上所述，本研究发现PD-1和PD-L1在Bowen病及cSCC中差异表达，并且与肿瘤分化程度和浸润深度相关，这为PD-1/PD-L1单克隆抗体用于治疗Bowen病及cSCC提供了理论依据。PD-1/PD-L1有望成为cSCC预后的生物标志物及免疫药物治疗的靶点。