杜忠礼，房忠菊，刘业海，朱玉华，陈立伟，孔欣茹，范俊达，任 楠，徐 伟，刘明波

1北京医院 国家老年医学中心，国家卫生健康委临床检验中心，中国医学科学院老年医学研究院，北京100730；2潍坊医学院 研究生院耳鼻咽喉教研室，山东潍坊 261053；3安徽医科大学第一附属医院 耳鼻咽喉头颈外科，安徽合肥 230022；4解放军总医院第一医学中心 耳鼻咽喉头颈外科，北京 100853；5解放军总医院海南医院 耳鼻喉头颈外科，海南三亚 572013；6山东大学附属省耳鼻喉医院 耳鼻咽喉头颈外科，山东济南 250021

手术、放疗和化疗是喉鳞状细胞癌临床治疗的标准方案，并且有一定的疗效，但中晚期喉癌患者预后仍然较差，研究显示晚期喉鳞状细胞癌患者5年生存率约为60%[1]。国内外学者正在积极探索晚期癌症患者治疗的靶基因或下游信号通路突变基因，如表皮生长因子受体、NOTCH2通路[2-4]。生物标志物对肿瘤治疗和预后具有重要意义，但目前仍然没有喉鳞状细胞癌的敏感生物标志物。LncRNA是由人类70% ～ 90%基因组编码的一种长度超过200个核苷酸的RNA分子[5]。LncRNA参与许多生物学过程，包括细胞代谢、免疫应答、染色质修饰、转录因子调控、mRNA加工和降解以及细胞信号转导等多种调控[6-7]。LncRNA的异常表达对结直肠癌[8]、多发性骨髓瘤[9]、肝癌[10]患者的生存均有显著影响。研究显示lncRNA与喉鳞状细胞癌患者的生存密切相关[11]。本课题组前期已对中国人群喉鳞状细胞癌患者进行全基因组关联研究，发现了3个遗传易感基因位点[12]。本研究继续对前期研究中的喉鳞状细胞癌患者进行生存随访，并在独立样本中验证，以鉴定出与喉鳞状细胞癌患者预后相关的lncRNA基因的多态位点。

资料和方法

1 资料 本研究分为两个阶段，为全基因组关联分析阶段和验证阶段，共635例患者。第一阶段为关联分析阶段，研究对象为2000年1月- 2012年12月在中国医学科学院肿瘤医院就诊的喉鳞状细胞癌易感性全基因组关联研究的98例患者[12]；第二阶段是验证阶段，研究对象为2009年1月-2018年3月在解放军总医院、安徽医科大学第一附属医院和山东大学附属耳鼻喉医院就诊的537例喉鳞状细胞癌患者。入组标准：1)民族为汉族；2)接受全喉切除术或喉部分切除术；3)经病理组织学确诊；4)随访生存资料完整。排除标准：1)既往有其他癌症病史或术前有抗癌治疗；2)术后不到1个月死亡；3)SNP分型信息缺失。收集患者的年龄、性别、吸烟、饮酒和肿瘤分期等临床资料。本研究获得解放军总医院伦理委员会批准(批件号：301HNFY伦审第16号)。

2 SNP筛选与分型 术前每例患者抽取3 ml外周静脉血，采用酚-氯仿法提取基因组DNA，用于多态位点的基因分型。全基因组关联分析阶段的SNP筛选：芯片SNP分型数据经过质控后有15 231个SNP位于lncRNA基因区域[12]，初步选取生存关联分析后与喉癌患者总生存显著相关的717个SNP(P值范围为1.08×10-4～ 0.005)。验证阶段的标签SNP筛选：对全基因组关联分析阶段初步选取的717个标签SNP进行再次筛选，筛选步骤如下：1)筛选次要等位基因频率≥0.05的SNP；2)采用单体型域的方法进行连锁不平衡分析，样本量大小的膨胀因子r2＞0.8，选择每个单体型域中P值最小的SNP。最终筛选出57个SNP在验证阶段进行验证。SNP分型：1)全基因组关联分析阶段的样本基因分型采用Affymetrix GeneChip Human Mapping 6.0芯片分型数据；2)验证阶段的样本基因分型采用Sequenom MassARRAY基因分型平台。

3 生存随访及分析 生存相关的全基因组关联分析是团队前期对喉鳞状细胞癌全基因组关联研究的延伸。首先由训练有素的研究人员通过医疗记录和电话信函方式获得随访信息，随访的内容包括患者的生存状态、死亡时间及死亡原因等。随访截止时间为2018年3月24日，635例患者获得完整生存随访数据。患者的总生存时间为手术日期至死亡日期或末次随访日期。随访截止时存活患者的生存数据为截尾数据。比较携带不同SNP基因型患者总生存的差异，运用显性模型、隐性模型和加性模型分别探讨SNP与总生存的关系。

表1 喉鳞状细胞癌患者的临床特征和生存情况Tab. 1 Clinical characteristics and survival of LSCC patients (n)

4 统计学方法 采用SPSS18.0版软件(SPSS，Chicago，IL)进行统计分析。采用χ2检验分析SNP的Hardy-Weinberg平衡。绘制Kaplan-Meier生存曲线并进行log-rank检验。通过多因素Cox回归比例风险模型计算死亡风险比(HR)及其95%CI。Haploview软件(v4.4)分析同一条染色体上SNP之间的连锁不平衡。所有检验均为双侧检验，检验水准α=0.05。

结 果

1 喉鳞状细胞癌临床特征和生存情况 全基因组关联分析阶段的98例患者的中位随访时间为65个月(3 ～ 113个月)，验证阶段537例患者的中位随访时间为70个月(1 ～ 115个月)。全基因组关联分析阶段49例(50.0%)死亡，验证阶段165例(30.7%)死亡。635例中按照喉癌UICC分期，0期14例，Ⅰ期51例，Ⅱ期128例，Ⅲ期223例，Ⅳ期 219 例 (表 1)。

2 与喉鳞状细胞癌患者总生存相关的基因多态位点 研究发现长链非编码基因LINC00908中的rs17059513(log-rank检验P=0.001)、LINC01813中的rs10208830(log-rank检验P=0.023)和LINC01185中的rs2901182(log-rank检验P=0.012)均与喉鳞状细胞癌患者总生存显著相关。校正年龄和肿瘤分期后，携带rs17059513 AG基因型患者的死亡风险显著高于携带rs17059513 AA基因型患者，多因素Cox回归结果显示HR(95%CI)为2.23(1.46 ～3.39)；携带rs290118CT基因型患者的死亡风险显著高于携带rs290118CC基因型患者，多因素Cox回归结果显示HR(95%CI)为2.10(1.11 ～ 4.00)；携带rs10208830 CC基因型患者的死亡风险显著低于携带rs10208830 GG基因型患者，多因素Cox回归结果显示HR(95%CI)为 0.75(0.61 ～ 0.92)。校正年龄和肿瘤分期后，多因素Cox回归加性模型分析显示rs17059513和rs10208830的HR(95%CI)分别为 1.95(1.34 ～ 2.83)和 0.77(0.63 ～ 0.93)；显性模型分析显示rs17059513和rs10208830均与患者总生存显著相关(log-rank检验P值分别为1.81×10-4和0.037)(图1A，图1B)，多因素Cox回归结果显示HR(95%CI)分别为 2.19(1.45 ～ 3.32)和 0.74(0.56 ～0.98)。隐性模型分析显示rs10208830与患者总生存显著相关(log-rank检验P=0.015)(图1C)，多因素Cox回归结果显示HR(95%CI)为1.59(1.10 ～2.30)。见表 2。

表2 三个基因位点与喉鳞状细胞癌患者总生存的关联分析Tab. 2 Associations of three loci with overall survival of LSCC patients

图1 基于显性模型分析rs17059513 (A)和rs10208830 (B)与喉鳞状细胞癌患者总生存的相关性，基于隐性模型分析rs10208830 (C)与喉鳞状细胞癌患者总生存的相关性Fig. 1 Associations of rs17059513 (A) and rs10208830 (B) with the overall survival of LSCC patients using dominant model, and association of rs10208830 (C) with the overall survival of LSCC patients using recessive model

图2 风险等位基因 (A, B)和风险基因型(C, D)与喉鳞状细胞癌患者总生存的相关性rs17059513 AG或GG基因型、rs10208830 GC或GG基因型和rs2901182 CT基因型是风险基因型。风险基因型数为3个位点的风险基因型数之和。rs17059513 G等位基因、rs10208830 G等位基因和rs2901182 T等位基因是风险等位基因。rs17059513 AG基因型、rs10208830 GC基因型和rs2901182 CT基因型均含有1个风险等位基因；rs17059513 GG基因型和rs10208830 GG基因型均含有2个风险等位基因。风险等位基因数为3个位点的风险等位基因数之和Fig. 2 Associations of risk alleles (A, B) and risk genotypes (C, D) with the overall survival of LSCC patients. The rs17059513 AG or GG genotype, the rs10208830 GC or GG genotype, and the rs2901182 CT genotype were considered as risk genotypes. The number of risk genotype was the sum of the risk genotypes in these three loci. The rs17059513 G allele, the rs10208830 G allele, and the rs2901182 T allele were considered as risk alleles. The rs17059513 AG genotype, the rs10208830 GC genotype, and the rs2901182 CT genotype contained one risk allele; while the rs17059513 GG genotype and the rs10208830 GG genotype contained two risk alleles. The number of risk alleles was the sum of risk alleles in these three loci

3 总生存相关的基因多态位点的累积分析 进一步对3个SNP进行累积分析，结果显示随着风险等位基因(图2A，图2B)或风险基因型(图2C，图2D)的增加，死亡风险比增加。携带3个风险等位基因的患者死亡风险最高，HR为3.11(P=2.00×10-4)(图2B)。携带2 ～ 3个风险基因型的患者死亡风险最高，HR为3.24(P=3.80×10-6)(图2D)。

讨 论

LncRNA最初被认为是基因转录的“噪音”，但近年来研究发现其是癌症发生和发展的重要调节因子，广泛参与肿瘤染色体的沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰等多种重要的调控过程，恰似一枢纽电路板以特有的内在方式连接诸分子单元，并调控其“逻辑运算”，调控靶基因的表达[13-16]。喉鳞状细胞癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，lncRNA在喉癌中的异常表达可作为喉癌早期诊断及生存预后的标志，以往的研究已经报道一些喉癌的生物标志物，如泛素交叉反应蛋白(UCRP)[17]、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)[18]、同源盒基因转录反义RNA(HOTAIR)[19]等。我们前期通过全基因组关联研究确定了中国人群喉鳞状细胞癌的遗传易感基因位点，相关文章发表在Nature genetics[12]。本研究发现，LINC00908基因的rs17059513、LINC01813基因的rs10208830和LINC01185基因的rs2901182与喉鳞状细胞癌患者的总生存具有显著相关性。

本研究是第一个关注喉鳞状细胞癌患者生存与lncRNA基因的多态位点相关性的研究。位于18q23号染色体的LINC00908基因内含子区的rs17059513显示出最显著的差异。有研究显示LINC00908可作为胶质瘤潜在的预后标志物[20]，但关于LINC00908功能的报道却很少。已有研究显示肿瘤代谢可以由lncRNA外显子的两个不同的等位基因进行特异性调节[21]。而本研究中发现的rs17059513的不同等位基因也可能通过某种未知的机制影响LINC00908的表达从而影响预后，所以需要进一步的研究来阐明该位点的功能。

rs10208830和rs2901182分别位于染色体2p16.1的LINC01813和LINC01185基因内含子区。有研究显示LINC01185所在的染色体2 p16.1区域与银屑病相关[22]。但迄今为止，对LINC01813和LINC01185功能的研究较少。本研究确定的3个位点对喉鳞状细胞癌预后具有累积效应。携带多个风险基因型或风险等位基因的患者较携带单个变异的患者有更差的预后。该结果提示发现与预后相关的基因位点，可借助其区分不同的预后人群，此可能成为预测喉鳞状细胞癌患者生存预后的潜在生物标志物。