陈 泽，张继彬，吕 娜，李永辉，周 薇，关 伟，高晓宁

解放军总医院第一医学中心，北京 100853 1血液科；2心血管内科

伴t(8；21)染色体易位的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)虽然是AML中预后较好的一个亚型[1]，但合并C-kit基因突变时则因复发率高而预后不佳[2]。C-kit是一种原癌基因，在约80%的AML患者中有表达，其突变频率为13% ～22%，在t(8；21) AML中其突变频率高达40%[3]。C-kit编码基因位于染色体4q11-12，其蛋白产物属3型酪氨酸激酶家族。C-kit蛋白通过与其配体，即干细胞因子结合，形成同源二聚体化从而促进细胞内酪氨酸残基磷酸化[4]，促进细胞信号转导，引起细胞信号改变，从而达到对某些造血细胞增殖、分化、凋亡等一系列调控[5]。C-kit基因突变可引起其下游信号通路异常活化，进而导致细胞增殖及凋亡紊乱，从而引发白血病。目前临床上对于携带C-kit基因突变的AML尚无有效治疗药物。我们前期研究发现，缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1α)，这一介导细胞缺氧应答反应的重要转录因子，在t(8；21) AML患者中选择性高表达，HIF1α特异性抑制剂棘霉素(echinomycin)能抑制t(8；21) AML细胞的增殖[6]。本研究拟在前期基础上，探索抑制HIF1α对携带C-kit基因突变的AML细胞中C-kit基因表达的影响及对细胞恶性生物学行为的作用。

材料与方法

1 试剂 棘霉素 (MERCK：330175)，RPMI1640细胞培养基(康宁：10-040-CVR)，胎牛血清(Hyclone：SV30087.03)，100× 青 霉 素 -链 霉 素溶液(白鲨：BL505A)，反转录试剂盒(Promega：A3500)，实时定量PCR试剂盒(KAPA：KK4601)，人甲基纤维素培养基(R&D Systems：4434)，兔抗人 C-kit抗体(CST：3074S)，兔抗人HIF1α抗体(CST：14179S)，兔抗人β-actin抗体 (CST：4970)，TRIzolTMReagent(Invitrogen：15596018)，BCA 蛋白定量试剂盒(碧云天：P0012S)，ECL化学发光试剂盒(Merck Millipore：WBKLS0100)，HRP标记山羊抗兔IgG抗体(CST：7074)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(索莱宝：CA1020)。

2 细胞培养及药物处理 携带C-kit基因突变的t(8；21) AML细胞系Kasumi-1和SKNO-1采用RPMI1640培养基(90% RPMI1640、10%胎牛血清、1%双抗)于37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养，每2 ～ 3 d更换1次细胞培养基。实验前1 d采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为1×105/ml接种于6孔板，每孔2 ml，实验当天采用终浓度为1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、30 nmol/L的棘霉素以及DMSO分别处理Kasumi-1和SKNO-1细胞，放置培养箱继续培养至24 h收集待测细胞。

3 实时定量RT-PCR法检测 mRNA表达收集细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，荧光定量PCR检测mRNA表达，引物由博迈德(北京)合成，C-kit前引物序列：5'-CGTTCTGCTCCTACTGCTTCG-3'，后引物序列：5'-CCCACGCGGACTATTAAGTCT-3'；HIF1α 前 引物序列 ：5'-GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG-3'，后引物序列：5'-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3'。反应条件为95℃预变性20 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，进行40次循环，最终72℃延伸15 min。反应结束后根据熔解曲线判断扩增产物，记录不同基因的Ct值。目的基因相对表达量应用2-ΔΔCt公式来计算，ΔΔCt=(Ct加药组目的基因-Ct加药组内参基因) - (Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因，比较mRNA的相对表达含量。每组实验独立重复3次。

4 Western blot 收集待测细胞，PBS洗涤后用100μl RIPA裂解液于冰上裂解细胞提取总蛋白，BCA法定量后采用SDS-PAGE凝胶电泳，通过湿转的转膜方法转到PVDF膜上(300 mA，110 min)，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加入C-kit(1∶1 000)、HIF1α抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次15 min。再加入HRP标记兔二抗(1∶10 000)，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，然后采用ECL化学发光法进行发光，经软件成像系统扫描目的条带后分析。以GAPDH作为内参照。每组实验独立重复3次。

5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集待测细胞，PBS缓冲液洗涤后加入500 μl PBS重悬，每组样本留取4管分别加入Annexin V 3μl、PI 3μl、Annexin V和PI各3μl、PBS(空白对照)，混匀后室温避光放置15 min，转移至流式管，1 h内流式细胞仪检测，每组实验独立重复3次。

6 克隆形成实验 收集待测细胞，在15 ml离心管中加入3 ml人甲基纤维素复合培养液待用，计数1 500个细胞加入300μl细胞培养液后，再加入甲基纤维素培养基中，涡旋振荡器充分混匀并静置5 min，将细胞放入两个3 cm培养皿中，3 d后开始密切观察克隆数以及克隆大小，每日拍照记录，计算7～14 d后的克隆数，每组实验独立重复3次。

7 统计学分析 采用Graphpad 7.0进行统计学分析。组间比较用Student-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 棘霉素对C-kit突变阳性的t(8；21) AML细胞系中HIF1α和C-kit的mRNA表达的影响 采用实时定量RT-PCR检测棘霉素处理后的Kasumi-1和SKNO-1细胞内HIF1α mRNA、C-kit mRNA表达变化。如图1所示，与经DMSO处理的对照组相比，HIF1α mRNA、C-kit mRNA表达均明显降低，且随棘霉素浓度增加，这一抑制作用逐渐增强。

2 棘霉素对C-kit突变阳性的t(8；21) AML细胞系中HIF1α和C-kit蛋白表达的影响 采用Western blot检测棘霉素处理后的Kasumi-1和SKNO-1细胞内HIF1α蛋白、C-kit蛋白表达变化。如图2所示，与DMSO对照组相比，HIF1α蛋白、C-kit蛋白表达明显降低，且随棘霉素浓度增加，这一抑制作用逐渐增强。

3 棘霉素对C-kit突变阳性的t(8；21) AML细胞系细胞凋亡的影响 用不同浓度棘霉素处理Kasumi-1和SKNO-1细胞24 h，显微镜观察，可发现细胞形态学上发生了明显变化。用DMSO对照处理的Kasumi-1，SKNO-1细胞，形状规则，大小一致，随着棘霉素浓度的增加细胞开始变大，出现细胞碎片，细胞数变少，形状不规则，且随着药物浓度增大细胞变化越来越明显。如图3所示，通过PI与Annexin V双染后流式细胞仪检测Kasumi-1、SKNO-1细胞凋亡情况可见，棘霉素处理24 h的细胞，与用DMSO对照处理的细胞相比，早期凋亡(PI与Annexin V双阳性)和晚期凋亡(PI阳性)细胞比例明显增加；而且随着棘霉素浓度增加凋亡细胞所占比例增高。

4 棘霉素对C-Kit突变阳性的t(8；21) AML细胞系增殖能力的影响 棘霉素处理后的Kasumi-1和SKNO-1细胞接种到克隆形成培养基中，7 ～ 14 d观察细胞增殖情况。如图4所示，随药物浓度增加，细胞克隆数明显下降，提示细胞增殖能力受抑制。

讨 论

原癌基因C-kit通过与其配体干细胞因子结合，调控造血干细胞早期增殖和分化[6]。C-kit基因突变后C-kit蛋白的活化不需要干细胞因子参与，即可持续刺激细胞的增殖、抑制细胞凋亡，促进白血病发生[6-9]。AML细胞系Kasumi-1和SKNO-1是携带t(8；21)染色体易位和C-kit基因突变的常见AML细胞系。研究表明，在Kasumi-1细胞系中存在C-kit基因Ash822Lys的激活突变[10]，Asn822在RTK家族的激活使Kasumi-1细胞系成为C-kit突变的AML的理想模型[11]，而SKNO-1是t(8；21)AML的第二个C-kit突变模型，两者的区别是Kasumi-1细胞为N822K突变杂合子，而SKNO-1为纯合子，所以本研究选择以上两种细胞系进行实验[11]。

HIF1α是缺氧条件激活的转录因子，调节着数百种影响细胞增殖凋亡的关键基因，其一旦被激活常提示肿瘤患者预后较差[11]。我们前期研究发现，HIF1α在t(8；21) AML患者中选择性高表达，抑制HIF1α可抑制t(8；21) AML细胞的增殖[6]。本试验中我们选择了HIF1α靶向抑制剂棘霉素处理Kasumi-1和SKNO-1两种细胞系，发现棘霉素处理细胞后，随着HIF1α表达水平的下降，C-kit基因mRNA和蛋白表达水平均明显降低，且随加药浓度增加，该抑制作用越来越明显，提示棘霉素可能通过抑制HIF1α表达进而抑制C-kit。当然，由于HIF1α与C-kit之间关系尚无报道，我们有必要进一步研究两者之间是否存在直接调控亦或是间接调控。

我们发现，伴随C-kit表达的降低，Kasumi-1和SKNO-1细胞系在经30 nmol/L的棘霉素处理后，相对于DMSO组早期凋亡和晚期凋亡都增加，且随药物浓度增加，凋亡情况加剧。C-kit基因突变是伴t(8；21)AML中的常见突变，发生率为12.7% ～ 47.2%[12-14]，并且C-kit的功能获得性突变导致其下游AKT、STAT3和MAPK[14]信号通路的激活，C-kit/PI3K/AKT通路增加了对细胞凋亡和Survivin表达的抑制使Survivin表达增加，降低促凋亡Bak蛋白的表达[15]。值得注意的是，Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的成员[16]，这种蛋白与Caspase-3和Caspase-7结合，阻断它们的作用，从而调控细胞凋亡。

我们还发现，伴随C-kit表达的降低，Kasumi-1和SKNO-1细胞系的体外细胞克隆形成数均明显减少，且随药物浓度增加，细胞增殖抑制情况越明显。有文献报道[15]，C-kit下游的MAPK家族主要包括p38、JNK1/2和ERK1/2三类酶，JNK信号已被证实和凋亡密切相关，磷酸化激活的JNK可促进c-jun的基因转录从而参与细胞的增殖，p38通过促进Caspase-3和PARP的活性来实现对凋亡的调节，这些信号分子通过磷酸化水平调节活性影响细胞的增殖及凋亡[17]。

图1 棘霉素对Kasumi-1和SKNO-1细胞系HIF1α和C-kit mRNA表达的影响(aP＜0.01, vs DMSO)Fig. 1 Effects of echinomycin on mRNA expression levels of HIF1α and C-kit genes in Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.01, vs DMSO)

图2 棘霉素对Kasumi-1和SKNO-1细胞系HIF1α和C-kit蛋白表达的影响(aP＜0.05, vs DMSO)Fig.2 Effects of echinomycin on protein expression levels of HIF1α and C-kit genes in Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.05, vs DMSO)

图3 棘霉素对Kasumi-1和SKNO-1细胞系细胞凋亡的影响(aP＜0.01, vs DMSO)Fig.3 Effects of echinomycin on apoptosis of Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.01, vs DMSO)

图4 棘霉素对Kasumi-1和SKNO-1细胞系增殖能力的影响(aP＜0.05, vs DMSO)Fig.4 Effects of echinomycin on cellular proliferation of Kasumi and SKNO-1 cell lines cells (aP＜0.05, vs DMSO)

综上，我们推测棘霉素可能通过抑制HIF1α表达从而影响C-kit，诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖。目前临床对于C-kit突变合并t(8；21) AML尚无有效靶向治疗药物，本研究为进一步将棘霉素应用于这类AML的治疗提供了实验基础。