丰磊，张婷，张金金，赵岚

作者单位：1南阳油田总医院内分泌科，河南 南阳 473132；2南阳医学高等专科学校基础医学部，河南 南阳 473000

动脉粥样硬化是2型糖尿病病人常见的并发症之一，同时也是增加心肌梗死、脑梗死等疾病发生风险的独立危险因素。内皮细胞位于血管最内层、是血管与血液循环之间的第一道防线，高糖诱导内皮细胞凋亡是糖尿病病人发生动脉粥样硬化的重要病理环节，针对内皮细胞凋亡进行干预是防治糖尿病病人动脉粥样硬化的有效靶点［1-2］。西格列汀是近年来广泛用于降糖治疗的二肽基肽酶4（DPP4）抑制剂，通过抑制DPP4活性、增加胰高血糖素样肽-1的含量来起到降糖作用［3］。已有研究报道，西格列汀能够在高糖环境下增加内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶的表达［4］，提示西格列汀可能在高糖环境下发挥内皮保护作用，但具体的保护效应及机制尚未明确。为此，本研究自2018年4月至2019年4月以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为对象，分析了西格列汀对高糖诱导HUVECs凋亡的改善作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 细胞 HUVECs细胞株购自中科院上海细胞资源中心，在液氮中冷冻保存。

1.1.2 试剂 西格列汀购自默沙东公司，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002购自Sigma公司，TUNEL凋亡染色试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司，B细胞淋巴瘤∕白血病-2（Bcl-2）、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、PI3K、AKT、人磷酸化磷酸肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的单克隆一抗购自Abcam公司。

1.1.3 仪器 荧光显微镜购自Nikon公司，化学显影仪购自Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1 HUVECs培养、分组及给药 HUVECs用含有10%胎牛血清、100 U∕mL青霉素、100 μg∕mL链霉素的DMEM进行贴壁培养，每2天更换1次培养液，细胞长至80%后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代接种在培养板内并分组。对照组用含有5.5 mmol∕L葡萄糖的DMEM处理，高糖组用含有33.3 mmol∕L葡萄糖的DMEM处理，西格列汀组在33.3 mmol∕L高糖的基础上参照戴尧［3］的研究、用含有20 μmol∕L西格列汀的DMEM处理，西格列汀+LY组用含有33.3 mmol∕L 葡萄糖、20 μmol∕L西格列汀、10 μmol∕L LY294002的DMEM处理，每个条件设5个复孔，连续处理24 h。

1.2.2 HUVECs凋亡检测 HUVECs接种在24孔板内，分组给药24 h后用TUNEL试剂盒进行染色，抗荧光猝灭封固液封固后在荧光显微镜下观察，对绿色荧光的细胞和蓝色荧光的细胞进行计数，计算两者比值为细胞凋亡率。

1.2.3 HUVECs中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、p-PI3K、p-AKT表达检测 HUVECs接种在6孔板内，分组给药24 h后用RIPA裂解液裂解细胞、提取蛋白，BCA试剂盒对蛋白进行定量后取30 μg蛋白样本进行蛋白质印迹法（Western blot）检测，将蛋白样本加入SDS-PAGE中，电泳后电转移至NC膜，用5%脱脂牛奶在室温封闭NC膜1 h，用Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的单克隆一抗在4℃孵育NC膜过夜。次日，用HRP标记的二抗在室温孵育NC膜1 h，最后加入ECL显影液、在化学显影仪中显影得到蛋白条带，根据条带的灰度值计算蛋白表达量。

1.3统计学方法采用SPSS 21.0软件录入数据，四组间计量资料的采用非参数检验（Kruskal-Wallis），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1西格列汀对高糖条件下HUVECs凋亡的影响与对照组比较，高糖组HUVECs的凋亡率明显增加（P＜0.05）；与高糖组比较，西格列汀组HUVECs的凋亡率明显减少（P＜0.05）；与西格列汀组比较，西格列汀+LY组的凋亡率明显增加（P＜0.05）。见图1。

2.2西格列汀对高糖条件下HUVECs中凋亡基因表达的影响与对照组比较，高糖组HUVECs中Bcl-2的蛋白表达量明显减少，Cleaved-caspase-9、Cleavedcaspase-3的蛋白表达量明显增加（P＜0.05）；与高糖组比较，西格列汀组HUVECs中Bcl-2的蛋白表达量明显增加，Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白表达量明显减少（P＜0.05）；与西格列汀组比较，西格列汀+LY组HUVECs中Bcl-2的蛋白表达量明显减少，Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白表达量明显增加（P＜0.05）。见图2，表1。

2.3西格列汀对高糖条件下HUVECs中PI3K/AKT通路的影响与对照组比较，高糖组HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表达量明显减少（P＜0.05）；与高糖组比较，西格列汀组HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表达量明显增加（P＜0.05）；与西格列汀组比较，西格列汀+LY组HUVECs中p-PI3K、p-AKT的蛋白表达量明显减少（P＜0.05）。见图3，表2。

图1 四组人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡率的比较（荧光染色×100）

图2 四组人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3的蛋白条带

表1 四组人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中Bcl-2、Cleaved-caspase-9、Cleaved-caspase-3蛋白表达的比较∕M（P25，P75）

图3 四组人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中p-PI3K、p-AKT的蛋白条带

表2 四组人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中p-PI3K、p-AKT蛋白表达的比较∕M（P25，P75）

3 讨论

近年来，2型糖尿病的发病率呈不断升高的趋势，相应糖尿病并发症的发病人数也不断增多，严重危害国民的生命健康［5］。动脉粥样硬化是糖尿病常见的血管并发症，以动脉粥样斑块形成为基本特征，可增加心肌梗死、脑梗死等心脑血管疾病的发生风险。血管内皮细胞的损伤是造成动脉粥样硬化发生的重要因素，糖尿病发生发展过程中内皮细胞的损伤与持续高糖环境的刺激有关［6］。多项研究证实，高糖条件能够引起内皮细胞发生凋亡［7-9］，这也是高糖刺激内皮细胞损伤的可能途径。本实验以HUVECs为对象、用高糖条件刺激后得到了与既往其他报道一致的结果，即高糖组HUVECs的凋亡率明显高于对照组。因此，抑制高糖诱导的HUVECs凋亡也被越来越多的学者视为防治糖尿病血管并发症的靶点。

西格列汀是一类二肽基肽酶4抑制剂，通过抑制二肽基肽酶4对胰高血糖素样肽-1的降解来增加体内胰高血糖素样肽-1的水平，进而通过胰高血糖素样肽-1的生物学活性来起到降糖作用。新近的多项研究报道，胰高血糖素样肽-1具有内皮保护作用［10-11］；国内戴尧的研究证实，西格列汀能够在高糖环境下增加内皮细胞中诱导型一氧化氮合酶的表达［4］，提示西格列汀可能也具有内皮保护作用。本实验在高糖条件下用西格列汀对HUVECs进行干预，观察凋亡率发现：西格列汀组HUVECs的凋亡率明显低于高糖组，说明西格列汀能够抑制高糖诱导的HUVECs凋亡、具有内皮细胞作用。

线粒体途径凋亡是目前已知在高糖环节下与内皮细胞凋亡密切相关的凋亡机制，Bcl-2基因是调控该凋亡途径的关键基因［12-13］。Bcl-2基因的编码产物定位于线粒体外膜，能够抑制线粒体内细胞色素C向细胞质的释放；进入细胞质的细胞色素C能够使pro-caspase-9裂解为有活性的cleaved-caspase-9，后者通过一系列级联反应使pro-caspase-3裂解为有活性的cleaved-caspase-3、进而引起细胞凋亡。Bcl-2通过抑制细胞色素C的释放来起到抗凋亡作用［14-15］。在本研究中，高糖刺激后HUVECs中Bcl-2的表达减少，cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表达增多；在用西格列汀处理后，HUVECs中Bcl-2的表达增多，cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表达减少，与细胞凋亡率的变化趋势一致，进一步证实西格列汀能够抑制高糖诱导的HUVECs凋亡。

在明确西格列汀对高糖诱导的HUVECs凋亡具有抑制作用后，本研究进一步分析了西格列汀发挥该作用的分子机制。PI3K∕AKT通路是具有促增殖、抗凋亡作用的信号通路，PI3K及AKT以磷酸化的形式发生活化后能够调节下游Bcl-2、4EBP1等基因的表达，进而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡［16-17］。本实验的分析证实，高糖组细胞中p-PI3K、p-AKT的表达明显减少，西格列汀干预后细胞中p-PI3K、p-AKT的表达明显增加，说明西格列汀对HUVECs的PI3K∕AKT通路具有激活作用。在西格列汀干预的同时联用PI3K的抑制剂LY294002后，西格列汀降低细胞凋亡率及cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达、增加Bcl-2表达的作用发生逆转，由此证实西格列汀对HUVECs中PI3K∕AKT通路的激活介导了其抑制凋亡的效应。

综上所述，西格列汀能够抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡且该作用与激活PI3K∕AKT通路有关，未来可设计临床研究来观察西格列汀对糖尿病病人动脉粥样硬化的防治作用。