祝伟霞， 杨冀州， 魏 蔚， 王新辉， 张淑霞

(郑州海关技术中心，郑州450003)

氧氟沙星（ofloxacin）是第二代氟喹诺酮类药物，对革兰氏阴性/阳性菌具有抗菌活性，主要用于水产养殖疾病的防治[1]。氧氟沙星易在动物体内残留，长期食用含有该药物残留的食品，可危害人类健康[2]。三文鱼以其独特的口味、丰富的营养，受到越来越多人的青睐。据联合国粮农组织统计，目前全球超过70%三文鱼来自于水产养殖业[3]。为保障人类身体健康，2015年我国农业部第2292号公告禁止氧氟沙星用于水产养殖过程中。我国是三文鱼的主要进口国家，为保障国内水产品的质量安全，急需建立三文鱼中氧氟沙星残留量的分析方法。

目前有关氧氟沙星的研究报道主要采用拉曼光谱法[4]、电化学法[5]、毛细管电泳法[6]、液相色谱法[7-10]和液相色谱-质谱/质谱法[11]。水产品中氧氟沙星残留测定需要液液萃取与离线固相萃取前处理方法[8-9]，操作繁琐，目前未见有关三文鱼中氧氟沙星残留量全自动分析的文献报道。为了提高分析效率，本方法设计了一种在线固相萃取净化方法，可以快速测定三文鱼中氧氟沙星的残留。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

TranscendTM在线净化液相色谱联合四极杆/静电场轨道阱质谱仪（美国Thermo Fisher公司）；T18涡旋混匀器(德国IKA公司)；3-16KL型离心机（日本Sigma公司）；N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司)；氧氟沙星标准品 (CAS 82419-36-1) 购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(96%)和乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)。

1.2 标准溶液的准备

称取氧氟沙星标准品10 mg加入甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，该标准溶液质量浓度为100 μg/mL，该溶液于-18 ℃以下保存，可稳定6个月。取上述标准溶液配制成质量浓度为1.0 μg/mL中间标准溶液，2 ℃～4 ℃保存，可稳定1个月。用水-乙腈（9:1）将中间标准溶液稀释成适当浓度的标准工作溶液。

1.3 仪器参数

在线固相萃取净化色谱柱为CycloneTM(50 mm×0.5 mm)；进样体积为50 μL；液相分离色谱柱为SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ(150 mm×2.0 mm,3.0 μm)；进样量为50 μL，TurboFlow上样泵流动相、HPLC流动相、其它仪器条件见表1。

表1 测定氧氟沙星oneline-SPE净化和色谱条件Table 1 Online -SPE conditions and HPLC parameters of Ofloxacin

检测器：四极杆-静电场轨道阱；离子化：正离子电喷雾（ESI+）；离子源温度：300 ℃；毛细管温度：350℃；喷雾电压：3400 V；鞘气：45 psi；辅助气：15 psi；质量扫描范围：m/z 200 amu～400 amu；监测模式：全自动触发二级扫描(dd-MS2)；母离子扫描分辨率为70000，子离子分辨率和阈值为17500和100000；碰撞能量为35 eV；氧氟沙星理论分子量365.1516，检测分子量362.1511，质量精度1.4 ppm，特征子离子318.1612和261.1034。

1.4 样品前处理

准确称取1.0 g匀质样品，加入4 mL乙腈混匀，超声提取10 min，4000 r/min离心2 min，取上清液氮吹至干燥，1 mL乙腈-水（9:1）溶解残渣，过0.22 μm滤膜，上机测定。

2 结果讨论

2.1 在线固相萃取条件的优化

氧氟沙星属中等极性的疏水物质，SPE方法常主要采用反相固相萃取和阳离子固相萃取柱净化。Turboflow技术是基于涡流色谱原理的样品制备方法，结合了扩散、化学吸附和体积排阻原理，在捕获目标化合物的同时快速除去复杂样品中的蛋白质及核酸等大分子物质，并消除基质干扰。实验采用不同在线固相萃取柱Cyclone（1×50 mm）、Cyclone-P（1×50 mm）和HTLC-C18（1×50 mm）进行了对比，发现Cyclone（1×50 mm）柱对分析物的保留作用最强，实验选择Cyclone（1×50 mm）柱为萃取柱。

实验分别试验了0.1%甲酸、水和0.1%氨水作为上样溶剂的效果。结果表明水为上样溶剂时，氧氟沙星保留最高，0.1%甲酸和0.1%氨水为上样溶剂时，分析物在固相萃取柱上的相对保留降低21.7%～46.2%。

实验比较了不同比例乙腈-0.1%甲酸溶液的洗脱效果。结果表明采用乙腈-0.1%甲酸（6:4）为洗脱溶剂，氧氟沙星回收率95.7%（见图1），当乙腈比例增加至100%，回收率无显著变化。考虑到目标物在分析柱柱头的聚焦，实验选择较低比例有机相，乙腈-0.1%甲酸（6:4）洗脱溶剂分析物可得到良好的峰形。

2.2 方法验证

方法采用不含氧氟沙星残留的三文鱼样品添加3种浓度水平进行检测，测得方法的最低检出浓度，经实验方法定量限为2.0 μg/kg。试验在三文鱼样品基质中添加3种浓度范围的标准溶液，测得线性范围1.0 μg/kg～100 μg/kg线性范围内，分析物的浓度与其峰面积呈良好的线性关系Y=8472X+1234(R=0.9994)。

试验选取阴性三文鱼分别在定量限、2倍定量限和5倍定量限浓度水平进行加标回收试验，每个浓度水平平行测定10次，方法回收率为68.7%～102.4%，相对标准偏差在6.7%～12.8%之间。

2.3 实际样品的测定

为验证该方法的有效性，收集了48份三文鱼样品进行分析。按照上述方法操作，根据保留时间和高分辨精确分子量进行确证，未检出氧氟沙星残留。本方法的分析结果与现行国家标准方法分析结果一致。

3 结论

该方法联合采用在线固相萃取净化与液相色谱-四极杆/高分辨静电场串联质谱技术，建立了三文鱼中氧氟沙星残留的鉴定方法，依靠高分辨精确母离子和二级精确子离子进行定性和定量，测定结果准确度误差小于5 ppm。经采用实际样品进行分析，证明本方法分析速度快，准确度高，可用于三文鱼中氧氟沙星的快速测定和确证。