李俊茹， 胡 菊， 冯 彩， 崔长海， 王良炎

（河南师范大学水产学院，河南新乡453007）

草金鱼（Carassius auratus），又称金鲫鱼或正彩鲫，是金鱼的原始类型，体形近似鲫鱼，是鲫鱼的一个变种，属鲤形目、鲤科、鲫属，具有观赏、食用等作用。另外，还可作为金龙鱼、银龙鱼等高档观赏鱼的饵料鱼，市场需求量较大[1]。

四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）是墨蝶呤经墨蝶呤还原酶（sepiapterin reductase，SPR）及二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）催化后生成，然后生成黄色或红色的蝶啶色素颗粒[2]。研究发现，spr的多态性与爬行动物壁虎的橙色体色有着重要关联[2]，另外，在青鳉鳞片不同种类色素细胞中，spr基因的定位也具有显著差异[3]，spr表达量在斑马鱼发育过程中随着黄色素细胞的增多而升高[4]。目前spr在草金鱼等其他观赏鱼类中的研究未见报道。本研究以草金鱼为实验对象，通过半定量方法探究spr与体色形成的关系，从而为研究草金鱼体色形成的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验对象所用草金鱼取自河南师范大学水产养殖基地。丁香酚麻醉后，分别对纯红、纯白、纯黄和纯黑草金鱼背部鳞片即红鳞、白鳞、黄鳞和黑鳞进行取材，鳞片浸入加有RNAlaterRTissue Collection（Thermo Fisher公司，美国）的1.5 mL灭菌EP管中，4 ℃过夜后放于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 总RNA提取、定量及完整性检测

按照RNAiso Plus试剂（TaKaRa公司，大连）说明书步骤提取不同颜色草金鱼鳞片总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳及紫外凝胶成像系统检测提取的RNA完整性。每个样品取1 μL RNA，ND-2000核酸蛋白仪检测RNA浓度和OD值，判断其纯度。

1.3 cDNA第一链合成

参照PrimeScriptTMRT反转录试剂盒（TaKaRa公司，大连）进行样品cDNA反转录，反转录产物于-20℃保存，用于半定量反转录聚合酶链式反应。

1.4 spr及内参基因β-actin的PCR扩增

根据定量PCR引物设计原则以及鲤科鱼类spr基因CDS区，通过Primer Plus 3.0（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）在线网站，设计spr特异性定量引物，β-actin为内参基因，引物送上海生工合成，引物信息见表1。

经过对引物核苷酸序列及不同退火温度下PCR产物电泳结果分析，spr基因片断扩增的最佳退火温度为58 ℃；β-actin基因片断扩增的最佳退火温度为60 ℃。

spr和β-actin基因的PCR反应采用20 μL体系，分别加入4 μL不同颜色草金鱼鳞片cDNA，10 μL Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye），上下游引物各0.6 μL（浓度为1μmol/L），加ddH2O至20 μL。反应在Perkin-Elmer 9600热循环仪上进行，PCR扩增程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min。产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，经紫外凝胶成像系统观察照相。所有样品分别取3次，进行3次半定量RT-PCR分析，相同结果达到2次以上，以保证实验的可靠性。

表1 spr PCR引物序列Tab.1 spr PCR primer sequence

1.5 电泳图片的获得与定量分析

PCR产物采用EB染色，1%琼脂糖凝胶电泳结束后，在紫外凝胶成像系统下拍照，并用Immage Master VDS Software分析软件对电泳结果进行定量分析。spr基因相对表达量以spr电泳条带的IOD（Integrated Optical Density）值与β-actin电泳条带的IOD值的比值表示。

2 结果

2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成

提取的不同颜色草金鱼鳞片总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测（图1），观测到清晰的28s、18s rRNA条带以及模糊的5s rRNA条带，28s条带为18s rRNA条带亮度的2倍，表明RNA完整性较好。ND-2000核酸蛋白仪检测RNA浓度和OD值，一般以1.8＜OD260/OD280（Ratio，R）＜2.0为标准，以保证RNA质量，合格RNA-80 ℃保存用于后续实验。

反转录合成cDNA后，通过内参基因β-actin验证（图2-A），观测到单一的条带并放于-80 ℃备用。反转录体系中RNA量均为1 μg，保证了反转录合成不同的cDNA样品之间可以达到良好的平行性，以确保半定量RT-PCR实验的一致性，提高半定量结果的可靠性。

2.2 spr基因在不同颜色草金鱼鳞片中的表达

不同颜色草金鱼鳞片中spr基因表达情况（图2）。本试验对spr和β-actin分别进行了不同颜色鳞片cDNA模板扩增的PCR反应，检测结果（图2-A）显示，spr基因在红色、白色、黄色、黑色鳞片中均有表达，spr基因的PCR产物电泳条带亮度在黑色鳞片、黄色鳞片、红色鳞片中逐级减弱，以在白色鳞片中最弱，用软件Immage Master VDS Software对电泳条带进行分析也得到了相同的结果，见图2-B。

3 讨论

草金鱼是一种具有经济价值、观赏价值的鱼类，但目前草金鱼体色的研究多集中在外部因素上，比如饲料成分、着色剂和饲料添加剂等对体色的影响，另外在草金鱼体色保存方面也有研究，但关于遗传因素对草金鱼体色影响的研究较少。蝶啶代谢通路是鱼类调控体色变化的一条重要代谢通路，SPR是其中的一种醛酮还原酶，以NADPH为辅酶催化蝶呤衍生物代谢。在催化BH4合成途径中，SPR是最后一步反应的必需酶[5]。同时，在补救途径中，SPR在催化SP分解及BH4合成中也扮演着重要的角色[2]。

关于青鳉的研究显示，SPR存在于黄色、黑色鳞片上的色素细胞中[4]，在金鱼的研究中发现，金鱼黑色素细胞中蝶啶的含量高于红色素细胞[6]，而spr基因表达水平可间接反映细胞内蝶啶含量。纯黑草金鱼鳞片具有黑色素细胞，纯红、纯黄草金鱼鳞片具有红/黄色素细胞和虹彩细胞，纯白草金鱼鳞片以虹彩细胞为主。研究结果显示，spr基因在黑色、红色、黄色鳞片中有较高表达，可能与这三种体色草金鱼鳞片包含的色素细胞种类有关即黑色素细胞、黄色素细胞和红色素细胞，这三种色素细胞均含有蝶啶，而spr的高表达保证了蝶啶的合成[7]。而spr基因在黑色鳞片中表达量最高，可能是黑色素细胞中蝶啶的含量相对于其他色素细胞较多有关，这与在金鱼[6]中的研究结果相似。spr在白色鳞片中表达较少，可能由于白色鳞片中虹彩细胞主要合成嘌呤，也可合成一部分蝶啶颗粒（主要是无色的颗粒）的缘故[8]。本研究初步揭示了spr基因在不同体色鱼类鳞片中mRNA水平表达情况，为深入探究spr在鱼类体色形成中的作用提供了基础数据。