王雪超，李雨雨，崔玉晗，郭志华，王盛

淄博市临淄区人民医院，山东淄博255400

耳聋是常见的单基因遗传病，也是常见的出生缺陷之一。据我国流行病学统计，每1 000个新生儿中就有1～3例聋儿，并且每年以3万人的速度在增长[1，2]，因此非常有必要应用耳聋基因检测联合听力筛查来预防耳聋的发生。目前，国际上共鉴定了97个非综合征型耳聋基因，152个相关位点[3]。长期以来，临床研究主要针对4种常见的耳聋基因，包括GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA、GJB3[2～5]等进行检测。近年来，许多研究者开始增加基因检测种类，如针对9种常见的耳聋基因甚至更多耳聋基因进行检测[1～5]，以期及早发现耳聋基因突变。临淄地区二孩政策放开后，出生人口增加35%以上。临淄地区自2017年7月开始进行新生儿耳聋基因筛查。本研究采用高通量测序技术检测临淄地区6 060例新生儿的18个遗传性耳聋基因的100个位点，全面、快速分析耳聋基因突变情况，为先天性、迟发性、药物性耳聋提供治疗依据和预防指导。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年7月～2018年10月在临淄区人民医院和妇幼保健院出生并自愿接受耳聋基因检测的6 060例新生儿为研究对象。新生儿中，男3 092例、女2 968例，出生Apgar评分7～10分；母亲年龄19～42岁，出生孕周37～41周。本研究通过医院伦理委员会批准，并获得新生儿监护人的知情同意。

1.2 方法 采集出生3～7 d充分哺乳的新生儿足跟血，制成≥8 mm的干血斑，于4 ℃保存。采用Mag Pure Blood DNA LQ Kit提取耳聋血片中的模板基因组DNA，并利用Qubit荧光计(Invitrogen)进行定量分析。采用引物-特异性标签序列进行多重PCR技术构建DNA文库并定量，利用One Touch2自动化乳液PCR仪扩增测序模板并使用ES磁珠纯化仪进行富集，采用Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit上机测序，进行数据分析。共检测18个基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、MT-RNR1、MT-COI、MT-TL1、MT-TS1、MT-TH、DSPP、GPR98、DFNA5、TMC1、MYO7A、TECTA、DLABLO、COCH、MYO15A、PRPS1)的共100个位点。BioelectronSeq 4000高通量测序仪购于北京博奥生物有限公司。对于阳性位点再使用Sanger测序进行验证，分析数据打印报告。另外，对于纯合或复合杂合突变的患儿，再采集父母双方的外周血进行家系突变位点的验证。

2 结果

2.1 耳聋基因单基因突变位点筛查结果 6 060例受检新生儿中，共检出耳聋基因突变者404例，突变携带率为6.67%。单基因杂合突变391例，其中GJB2突变携带者157例，携带率2.59%(157/6 060)；SLC26A4突变携带者169例，携带率2.79%(169/6 060)；GJB3突变携带者18例，携带率0.30%(18/6 060)；线粒体耳聋相关基因突变携带者46例，携带率0.76%(46/6 060)；MYO7A突变携带者1例，携带率0.02%(1/6 060)。见表1。

表1 6 060例新生儿耳聋基因单基因突变位点筛查结果

2.2 两个及以上耳聋基因位点突变筛查结果 404例耳聋基因突变者中发现13例两个及以上耳聋基因位点突变，突变携带率0.21%(13/6 060)。其中，GJB2基因c.299-300delAT纯合突变1例，GJB2基因c.235delC/c.299-300delAT复合杂合突变1例、双杂合突变10例，以及罕见的GJB2/SLC26A4 c.235delC/c.299-300delAT/c.2168A>G三个位点突变1例。见表2。同时，对这些特殊新生儿进行定期随访并提供遗传咨询和指导，分别采集GJB2基因c.299-300delAT纯合突变、GJB2基因c.235delC/c.299-300delAT复合杂合突变、c.235delC/c.299-300delAT/c.2168A>G三个位点突变新生儿父母的外周血，进行Sanger位点验证，发现3例基因突变均来自新生儿父母双方。见图1。

表2 6 060例新生儿两个及以上耳聋基因位点突变筛查结果

注：A为GJB2基因c.299-300delAT纯合突变；B为GJB2基因c.235delC杂合突变；C为GJB2基因c.299-300delAT杂合突变；D为SLC26A4基因c.2168A>G杂合突变。

2.3 追踪随访结果 对6 060例新生儿于出生后3～7 d使用美国产ALG03I(AABR)听力筛查仪进行听力筛查，56例新生儿未通过听力筛查，转诊至听力检查中心。生后6个月确诊听力异常患儿12例，其中双耳重度耳聋6例，左耳轻度、右耳重度耳聋4例，左耳重度、右耳中度耳聋2例。12例患儿中，携带耳聋基因8例(66.67%)，GJB3基因突变3例，GJB2基因突变4例，SLC26A4基因突变1例。

3 讨论

研究发现，引起耳聋的主要原因有遗传因素(约占60%)和环境因素[3]。在所有遗传性耳聋中，约70%为非综合征型耳聋，其余30%为综合征型耳聋，即除耳聋外还伴有其他相关器官或系统疾病[1]。本研究利用高通量测序技术检测了6 060例新生儿的18个耳聋基因的100个位点，共发现耳聋基因突变404例，突变携带率6.67%，高于北京市海淀区的4.7%[5]、长治地区的5.15%[6]和珠海市的4.2%[1]。临淄地区耳聋基因突变检出率高于全国大部分地区，可能与检测基因位点多、覆盖面广、各地遗传背景存在差异有关。

6 060例新生儿中，4个常见耳聋基因(GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体基因)的常见20个位点突变携带率为4.9%。该携带率略高于韩萍等[5]研究的4.7%(北京海淀区90 816例新生儿，检测4个常见耳聋基因9个位点)；高于潘丽等[1]研究的4.2%(珠海市9 775例新生儿，检测4个常见耳聋基因20个位点)；略低于李晓泽等[6]研究的5.15%(长治地区19 113例新生儿，检测4个常见耳聋基因9个位点)。这表明检测相同耳聋基因和位点，所得到的突变携带率与全国其他地区基本一致[4，7，8]。

GJB2基因是导致非综合征型遗传性耳聋最常见的突变基因，该基因位于13q11～q12，编码缝隙连接蛋白26，属于常染色体隐性遗传[7]。该基因纯合或复合杂合突变可导致双耳先天性重度、极重度感音神经性耳聋，发病年龄主要在婴幼儿期[8]。本次筛查共检出157例(携带率2.59%)GJB2单基因杂合突变、6例双杂合突变；同时检出1例纯合突变、1例复合杂合突变、1例三个位点突变，对这3例患儿进行重点随访，目前患儿均在1～2岁，对声音反应较好，可能为迟发性耳聋，建议定期监测听力，如发现异常需尽早干预。SLC26A4基因位于7q31，编码穿膜蛋白Pendrin，属于常染色体隐性遗传，其突变会导致先天性或迟发性耳聋，通常伴有前庭水管扩大，建议避免头部外伤和感冒等[9]。本研究筛查发现169例(携带率2.79%)SLC26A4单基因突变，4例双杂合突变。GJB3基因位于1p33～35，编码缝隙连接蛋白31，属于常染色体隐性或显性遗传[10]。本研究筛查发现18例GJB3基因杂合突变，该突变均关联常染色体显性遗传，通常起病于青少年期或成人期，一般表现为进行性高频听力受损，少数患者表现为中重度耳聋[10，11]。线粒体耳聋相关基因属于母系遗传，突变者本人与母系成员均应禁用氨基糖苷类药物，避免发生药物性耳聋[12]。目前线粒体耳聋相关基因研究最多的为线粒体12SrRNA的1555A>G和1494C>T位点。我们在这两个位点基础上增加4个基因的6个位点，共检出46例(携带率0.76%)线粒体耳聋基因单杂合突变，5例双杂合突变。MT-RNR1 1555A>G突变共有31例，突变携带率0.512%，其主要引起药物性非综合征型母系遗传性耳聋，为双侧性，程度不等，与氨基糖苷类药物有关，关键在预防[13～17]。对以上筛查新生儿追踪随访，显示对声音反应较好，嘱家长注意定期监测患儿听力，避免药物性耳聋等。听力异常患儿耳聋基因携带者占66.67%，提示有一部分新生儿虽然携带耳聋基因，但现阶段对声音反应较好，与临床表现不符，可能与环境因素、遗传特质、药物性、迟发性等有关，而关键在预防[17]。

比较全国其他地区，如长治地区、北京市海淀区、珠海地区等，临淄地区筛查的18个耳聋基因的100个位点，除常见4个耳聋基因热点突变位点外，我们发现以下基因位点突变携带率相对较高，如GJB2基因c.257C>G 10例(携带率0.165%)，SLC26A4基因c.919-18T>G 12例(携带率为0.198%、有1例双杂合突变)、c.697G>C 10例(携带率0.165%)，MT-CO1基因m.7444G>A 9例(携带率0.149%)。可能由于筛查的位点较多，临淄地区新生儿耳聋基因突变总携带率为6.67%，高于其他地区[15～17]。

总之，高通量测序技术以其全面、快速、准确、高通量的特点，在耳聋基因检测方面具有广阔的前景。利用高通量测序技术筛查新生儿耳聋基因突变，检测位点多，检出比率较高，可预防的对象多，能够尽早对患儿进行干预。对于耳聋基因突变携带者建议健康用耳，避免使用耳毒性药物，再婚育时配偶需行耳聋基因检测[14，15，17]。同时对孕妇进行耳聋基因筛查，及时发现耳聋缺陷，避免聋儿出生。另外，通过大规模基因筛查，可以建立本地区耳聋基因突变位点的分布和发病情况预测模型，对耳聋防控有实际意义[16]。以上研究数据也将为全国其他地区耳聋基因筛查提供参考。