田树波，刘景磊，彭利盼，孔帅

山东第一医科大学附属省立医院，济南250021

胃癌是严重影响人们健康和威胁生命的常见肿瘤[1]。胃癌治疗主要是以手术为主的综合治疗[2]。胃癌的发生发展机制还未完全阐明，并且缺乏有效的早期诊断标志物。因此，寻找和鉴定胃癌分子标志物，对于胃癌的早期诊断、治疗及预后评估十分重要。三结构域蛋白(TRIM)家族由众多成员构成[3]，部分成员在肿瘤发生发展过程中参与了细胞的转录调控、细胞的增殖凋亡等过程，从而发挥促癌或抑癌的作用[4,5]。TRIM家族蛋白结构多样性的特点，决定了其功能的多样性。TRIM55也称肌肉特异性RING锌指蛋白2(Murf 2)，其可维持肌肉发育和心肌功能。TRIM55在骨骼肌分化和肌纤维生成的早期阶段发挥重要作用[6]。研究表明，在SARS-CoV感染中，miR-30-5-5p可以调控TRIM55的表达[7]。TRIM55在肝癌组织中低表达，是肝癌的独立预后因素，其可以通过上皮-间质转化(EMT)和MMP2通路调节肝癌细胞的侵袭转移[8]。本研究观察了胃癌组织中TRIM55的表达变化，探讨TRIM55与预后的关系，以及TRIM55对胃癌细胞恶性生物学行为的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 胃癌组织及细胞来源 选取山东省立医院胃肠外科2014年7月～2015年12月收治的具有完整随访资料的91例胃癌患者的肿瘤组织及癌旁正常胃黏膜组织标本，所有组织均经HE染色病理检查证实。91例患者中，男61例、女30例，平均年龄63.6岁。收集患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤病理分期及淋巴结转移情况等资料。随访自术后1个月开始，主要是以电话和门诊复诊的方式，随访至患者死亡或截至2019年12月。91例中，死亡56例，存活35例。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。胃癌MGC803细胞培养于含10%胎牛血清的培养基中，并于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。当细胞融合度至80%～90%时按照1∶2比例将细胞传代。

1.2 胃癌组织中TRIM55检测 将胃癌组织制作成病理组织芯片，然后进行染色。先用二甲苯进行脱蜡，柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复。PBS洗4次后用BSA封闭液37 ℃封闭，滴加TRIM55一抗(1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS洗4次。按照免疫组化检测试剂盒说明书，加入二抗，室温孵育20 min。PBS清洗后，加入链霉亲和素-过氧化物酶结合物，孵育20 min。用DAB进行染色，镜下观察着色情况，终止显色后用苏木素复染，脱水。加入二甲苯透明后用中性树脂封片。在显微镜下观察并拍照，用图像分析软件对图片进行分析。根据染色强度评分，无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、褐色为3分；按阳性细胞百分比评分，无阳性细胞为0分、1%～10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分。两项得分相乘，≥4为TRIM55高表达。

1.3 TRIM55低表达后胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力观察

1.3.1 细胞分组及TRIM55 siRNA转染 将胃癌细胞分为两组，即转染靶向TRIM55的siRNA组(si-TRIM55组)和转染阴性对照干扰组(si-NC组)。根据TRIM55的CDS编码序列，构建靶向TRIM55基因片段的siRNA。siRNA-TRIM55上游序列为5′-AUCAAACUUCUCACAAAGCUC-3′，下游序列为5′-GCUUUGUGAGAAGUUUGAUUA-3′；阴性对照si-NC上游序列为5′-UUCAUUUAGGGAGUUCAACCA-3′，下游序列为5′-GUUGAACUCCCUAAAUGAAUG-3′。应用Lipofectamine2000分别将siRNA-TRIM55或si-NC转染MGC803细胞。应用TRIzol试剂提取胃癌细胞中的总RNA，分光光度计下测定OD260/280值，测定RNA浓度。采用TaKaRa逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，采用real-time PCR法检测TRIM55，以GAPDH为内参。TRIM55上游引物序列为5′-GGTTTTGGATAGACATGGGGT-3′，下游引物序列为5′-TTCTCCTCTTGGGTTCGGGT-3′。以2-ΔΔCt表示TRIM55的相对表达量。结果si-TRIM55组TRIM55 mRNA相对表达量低于si-NC组(P<0.05)，转染成功。

1.3.2 胃癌细胞增殖能力观察 胃癌细胞培养于6孔板中，转染36 h后，将细胞以2×103个/孔的密度接种到96孔板中，分别于24、48、72、96 h后向每孔加入10 μL的CCK-8，于培养箱孵育4 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值(OD450)，根据OD值绘制细胞生长曲线。

1.3.3 胃癌细胞迁移、侵袭能力观察 取对数生长期的胃癌细胞，胰酶消化后以无血清培养基重悬并调整细胞密度为1×106/mL，取200 μL接种于Transwell板的上室，下室内加入含10%胎牛血清的培养基。侵袭实验需要在小室内膜表面铺基质胶。细胞于培养箱中培养48 h后，弃去上室内培养基并用棉签擦去上室内残余细胞，多聚甲醛固定下室细胞30 min后用结晶紫染色，于显微镜下观察下室内细胞的数量。

2 结果

2.1 胃癌组织中TRIM55表达变化及与肿瘤临床病理参数的关系 TRIM55定位于细胞核与细胞膜，呈棕褐色颗粒，主要表达于细胞核(图1)。91例胃癌组织中TRIM55高表达40例，癌旁组织中TRIM55低表达，胃癌组织中TRIM55高表达率高于癌旁组织(P<0.05)。不同年龄、性别、肿瘤位置和Lauren分型患者TRIM55表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。Ⅰ+Ⅱ期者TRIM55高表达率低于Ⅲ期者，无淋巴结转移者TRIM55高表达率低于有淋巴结转移者，T1+T2期者TRIM55高表达率低于T3+T4期者(P均<0.05)。详见表1。

注：A为癌旁正常胃黏膜组织；B为高分化胃癌组织；C为低分化胃癌组织；D为胃印戒细胞癌组织。

2.2 TRIM55表达与胃癌预后的关系 TRIM55高表达患者5年生存率低于低表达者(P=0.026，图2)。TRIM55高表达、低表达患者中位总生存期(OS)分别为34个月(95%CI:13.3～62.8)、57个月(95%CI:25.5～84.5)，TRIM55高表达者中位OS短于低表达者(P<0.05)。单因素COX回归分析结果显示，肿瘤T分期、淋巴结转移、肿瘤TNM分期和TRIM55表达水平是胃癌患者预后的影响因素；进一步行多因素COX回归分析结果显示，淋巴结转移、TNM分期、TRIM55表达水平是胃癌预后的独立影响因素(见表2)。

2.3 TRIM55低表达后胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力变化 si-TRIM55组培养24、48、72、96 h细胞增殖能力均低于si-NC组(P均<0.05)，见表3。迁移实验结果显示，si-TRIM55组、si-NC组穿膜细胞数分别为(117.6±6.4)、(223.4±16.3)个，侵袭实验结果显示，si-TRIM55组、si-NC组穿膜细胞数分别为(76.8±5.2)、(158.5±7.6)个，两组穿膜细胞数相比，P均<0.05。见图3。

表1 不同临床病理参数胃癌患者TRIM55高表达情况比较

图2 TRIM55表达与胃癌患者生存率的关系

3 讨论

TRIM55属于TRIM蛋白家族，其在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。TRIM蛋白拥有3个特征性结构域，作为E3连接酶发挥作用，可以介导蛋白的泛素化，通过降解靶分子，进而参与调节细胞内的病理生理过程和肿瘤相关进程[9～11]。TRIM蛋白主要通过调节p53及NF-κB信号通路等多种机制，影响肿瘤相关因子表达而发挥促癌或抑癌的作用[12～14]。TRIM59在乳腺癌中过表达并与较高的TNM分期和淋巴结转移相关，其过表达可以促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、转移，增强肿瘤细胞对顺铂的耐药性；TRIM59过表达还可以促进乳腺癌细胞p53的泛素化过程，导致p53降解，促进肿瘤进展[15]。TRIM24蛋白在胃癌中高表达，并且与胃癌的临床分期、局部侵犯和较差的预后有关；TRIM24过表达也可导致胃癌细胞对5-FU耐药并促进胃癌细胞生长[16]。还有研究表明，TRIM32的表达与胃癌较差的预后相关，其作为促增殖、抗凋亡因子参与胃癌的AKT信号通路调节，还可以通过靶向胃癌细胞中的GLUT1和HKⅡ加强糖酵解[17]。研究表明，TRIM55在结直肠癌中定位于细胞核且高表达，TRIM55阳性表达患者5年生存率明显低于阴性患者[18]。TRIM55作为E3泛素连接酶可以通过影响细胞因子信号转导抑制因子1的表达进而促进结直肠癌细胞增殖[19]。一项纳入芬兰心力衰竭人群的研究显示，TRIM55表达缺失或TRIM55 E140K变异体过表达与心脏收缩能力减弱密切相关[20]。还有研究报道，TRIM55在系膜增生性肾小球肾炎的发展过程中起到调节TNF-α-CCL2通路、促发炎症反应的作用[21]。

表2 胃癌患者预后影响因素COX分析结果

表3 si-TRIM55组、si-NC组培养不同时间细胞增殖能力比较

注：A为迁移实验；B为侵袭实验。

本研究首次探讨了TRIM55在胃癌中的表达及生物学功能，通过组织芯片免疫组化法检测了TRIM55在91例胃癌组织和癌旁组织中的表达，结果表明TRIM55在胃癌组织中高表达，生存分析显示TRIM55高表达者5年生存率和OS降低，COX回归分析也证实TRIM55是胃癌预后的独立影响因素。分析TRIM55表达与胃癌临床病理参数的关系，结果显示，TRIM55表达与胃癌T分期、淋巴结转移和TNM分期有关。以上结果提示，TRIM55可能参与了胃癌的发生发展过程。

为了研究TRIM55在胃癌细胞中的功能，我们构建了靶向TRIM55的siRNA，转染至胃癌MGC803细胞中，降低TRIM55的内源性表达。通过CCK-8增殖实验证实，敲低TRIM55基因并使其低表达可以明显抑制胃癌细胞的增殖。Transwell实验表明，胃癌细胞转染TRIM55 siRNA后，能够穿过基底膜的细胞数目明显减少。这些结果提示，TRIM55在胃癌中可能发挥癌基因的功能，降低其表达可以抑制胃癌细胞的恶性增殖过程，抑制胃癌细胞的侵袭和转移。

综上，本研究探讨了TRIM55作为肿瘤促进因子的生物学效应，TRIM55在胃癌组织中高表达，有望作为胃癌预后不良的独立标志物。但是TRIM55促进胃癌细胞侵袭、转移的分子生物学机制未知，下一步应继续探讨其具体作用的信号通路，以期为胃癌的临床治疗提供新的治疗策略和分子靶点。