赵禹

[摘要] 目的 探討实时荧光定量PCR技术在手足口病检测中的应用。 方法 选择本溪市疾病预防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患儿作为研究对象，根据检测方法不同分为对照组和观察组。对照组利用常规PCR技术检测手足口病组，实时荧光定量PCR技术检测手足口病为观察组。比较两组的检出肠道病毒分型EV、EV71、CoxA16阳性率，特异性和灵敏度。 结果 采用实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术检测手足口病肠道病毒分型EV、EV71、CoxA16的阳性率及两组特异性和灵敏度相比，观察组检测阳性率为66.67%，明显高于对照组检测阳性率的21.67%，观察组检出阳性率高于对照组，两组均有特异性，观察组灵敏度优于对照组，对照组最低检测限均为4.11×103 cfu/mL。而观察组均为4.11×102 cfu/mL。 结论 荧光定量PCR技术在检测肠道病毒中不仅具有特异性高，还具有灵敏度高、检测时间快的特点，有助于更快诊断手足口病，更好的服务于临床。

[关键词] 手足口病;荧光定量PCR;柯萨奇病毒A组16型;肠道病毒71型

[中图分类号] R440          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）15-0148-03

Application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in detection of hand-foot-mouth disease

ZHAO Yu

Department of Microbiology， Benxi Center for Disease Prevention and Control in Liaoning Province， Benxi   117000， China

[Abstract] Objective To explore the application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in the detection of hand-foot- mouth disease. Methods A total of 120 children with hand-foot-mouth disease treated in Benxi Center for Disease Prevention and Control from February 2018 to June 2019 were selected as research subjects. They were divided into the control group and the observation group according to different detection methods. Patients with hand-foot-mouth disease detected by conventional PCR technology were classified as the control group， and those detected by real-time fluorescent quantitative PCR technology were classified as the observation group. The positive rates， specificity， and sensitivity of enterovirus（EV） typing， enterovirus 71（EV71）， and coxsackievirus A16（CoxA16） were compared between the two groups. Results The positive rates of EV typing， EV71， and CoxA16， specificity and sensitivity in detection of hand-foot-mouth disease using real-time fluorescent quantitative PCR and conventional PCR were compared. The positive rates in the observation group and the control group were 66.67% and 21.67%， respectively. The positive rate in the observation group was significantly higher than that in the control group. Specificity was showed in both groups. The sensitivity in the observation group was higher than that in the control group. The minimum detection limit of the control group was 4.11×103 cfu/mL and that of the observation group was 4.11×102 cfu/mL. Conclusion Fluorescent quantitative PCR technology is with high specificity， high sensitivity and fast detection time， which benefits the faster diagnosis of hand-foot-mouth disease and serves clinical care better.

[Key words] Hand-foot-mouth disease; Fluorescent quantitative PCR; Coxsackievirus A16; Enterovirus 71

手足口病主要致病菌是肠道病毒，该传染病的主要传播途径是通过消化道、呼吸道和密切接触等[1]，人群较易受感染，但多见于婴幼儿。其发病率最高人群为5岁以下儿童，肠道病毒可以引起多种传染病如脊髓灰质炎、柯萨奇病毒、手足口病等，但引起手足口病最为常见的是肠道病毒71型（Human enterovirus 71， EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxsackievirusA16，CoxA16），但近年来引起并发症主要以EV71分型为主，该病的发病流行特点是一年四季均可以发病，尤以夏秋季节最多见[2]。临床表现以手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹为特征，但部分的EV71感染者可出现无菌性脑膜炎、神经性肺水肿、心肌炎、循环障碍等危重并发症，感染肠道病毒分型EV71是死亡的主要原因，目前缺乏有效的治疗药物，本病传染性強，易引起暴发或流行[3]。以前的实验室诊断手足口病中的肠道病毒病原体的方法是血清学方法和病毒分离培养，但这两种方法有检测速度慢、耗时长的局限性，且对专业人员的技术要求门槛高，无法准确对暴发疫情做出应有的诊断和治疗，因此本文选择我中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口患儿作为研究对象，并取得了较好的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本溪市疾病预防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患儿的病历资料，根据检测方法不同分为对照组和观察组，每组各60例。对照组男48例，女12例;年龄0～4岁，平均（3.50±0.35）岁;病程2～10 d，平均（7.78±0.81）d;观察组：男37例，女23例;年龄0～3岁，平均（2.40±0.47）岁，病程3～9 d，平均（7.53±0.77）d。纳入标准：经肠道病毒传染者;出现口痛、厌食、低热者。手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡且大多1周左右可自愈者。排除标准：既往有其他感染症状者;手、足、口腔等部位有疱疹或溃疡且较难自愈者;免疫力低下者;严重心、肝、肾功能异常者[4]。幼儿手足、臀部皮疹及口腔疱疹和溃疡的临床表现应考虑手足口病。临床诊断具有下列之一的特点即可确诊为手足口病：一、肠道病毒特异性核酸（EV71、CoxA16）检测阳性;二、分离肠道病毒病并鉴定为EV71、CoxA16或者其他肠道病毒;三、急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体滴度4倍以上。手足口病诊断标准严格按照《感染病学八年制教材第3版》[5]进行。两组患者的性别、年龄等资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。该研究得到本溪市疾病预防控制中心伦理委员会的批准，每例患儿家属均签署了知情同意书。

1.2 标本运送和保存

相应的科室采集后的标本应存放于相应的标本保存液，及时冷藏运至实验室以免耽误最佳检测时间。实验室检测样本完成后应立即放入-80℃ 冰箱保存。低温保存使病原体的活性降低。

1.3 主要仪器及试剂

实时荧光PCR仪购于美国应用系统公司ABI7500，凝胶成像仪购于美国BIO-Rad UV HOODⅡ。RNA提取、实时荧光定量PCR试剂均购自美国QIAGEN公司;肠道病毒通用型核酸检测试剂盒（Human enterovirus，EV）、（EV71）和（Cox A16）均购于上海之江公司生产，琼脂糖购自GIBIO公司。所有试剂均在有效期内使用。引物探针EV、EV71 和 Cox A16序列在Gen Bank数据库搜索且设计。常规PCR引物序列参考《手足口病防控指南》中的引物设计，由生工公司合成。

1.4 操作方法

1.4.1 荧光定量PCR检测手足口病的病原体的操作标准  流程严格按照购买试剂盒的方法执行，先按照试剂盒提取病毒RNA后按PCR总体系25 μL和PCR反应条件：45℃10 min→95℃15 min→95℃15 s → 60℃60 s循环40次进行扩增。

1.4.2  常规PCR检测手足口病的病原体操作标准  流程如下：先用Primer 5.0设计引物由特定的生物公司合成，其次试剂盒提取病毒RNA，PCR总体系25 μL依次加入Taq酶，逆转录酶，反应液，质控液等。PCR反应条件：45℃10 min→95℃15 min→95℃15 s→60℃60 s循环40次进行扩增，结束后2%琼脂糖进行电泳，用凝胶成像仪观察 PCR产物并拍照电泳结果。

1.5 观察指标

观察并记录两组肠道病毒分型EV、EV71、CoxA16阳性率、特异性、灵敏度。该研究阳性率通过χ2检验计算而得，该研究采用实时荧光定量PCR技术方法和常规PCR技术方法分别检测肠道病毒的阴性和阳性来确定其特异性。检测系列稀释的已知拷贝数的RNA 浓度根据最低效价比来确定其灵敏度[6]。

1.6 统计学分析

本研究所有数据均采用统计学软件SPSS 20.0分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肠道病毒阳性率检测结果比较

对 120份咽拭子标本同时进行两种方法的检测，其中观察组检测阳性率为66.67%，明显高于对照组检测阳性率的21.67%。观察组检出 EV阳性13份，EV 71阳性19份、Cox A16阳性8份，阴性份数20份，对照组检出 EV阳性5份，EV 71阳性6份、Cox A16阳性2份，阴性份数47份。观察组检出阳性率高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 两组肠道病毒及分型的特异性比较

两组通过肠道通用反应液、V71反应液、CoxA16对肠道病毒EV、EV71、CoxA16、诺如病毒、轮状病毒进行特异性比较，发现两者结果一致，说明两组对检测手足口病均有特异性。见表2。

2.3两种方法检测肠道病毒的灵敏度分析

将手足口病菌悬液浓度为4.11×107 cfu/mL 进行 10 倍梯度稀释，比较两种方法的检测手足口病的灵敏度，发现对照组最低检测限均为4.11×103 cfu/mL。而观察组最低检测限均为4.11×102 cfu/mL，由此可知观察组的检测灵敏度高于对照组。见表3。

3 讨论

手足口病的发病机制是病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜和淋巴组织中繁殖并引起局部的症状[7]。该病的临床特征是低热、手、足、口腔等出现小疱疹或者小溃疡，绝大数患儿7 d左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症[8]。该病流行特点是有明显的季节性和聚集性。该病分布广泛，传播速度较快且传染性强，隐性感染者居多，显性感染者和隐性感染者之比为1：100[9]，所以早期发现该病有利于疾病的控制。既往引起手足口病的病毒CoxA16，之后發现EV71病毒才是引起本病的危险因素，本研究发现分离EV71阳性率高于CoxA16，与国内数次暴发的此病的特点具有一致性[10]。早期用于检测肠道病毒的方法是血清学方法和病毒分离法，但两种方法具有操作复杂、耗时、准确率低的特点，不能满足快速诊断该病的需要[11-13]。随着医学技术的发展，近年来国内常用检测手足口病的方法是常规PCR方法，虽然此方法也可以快速检测病毒核酸，但易产生污染，且此过程需要溴化乙锭等染料具有致癌性。荧光定量PCR技术是目前国际上检测手足口病病毒最先进的检查方法，因为荧光定量PCR技术具有以下的优点：一、高灵敏性和准确性，对于DNA浓度要求低。二、操作简单、耗时少。三、安全、无污染，因为都在封闭状态下进行PCR扩增和产物分析，不需要琼脂糖电泳和紫外照射。四、结果重复性好，实时观测结果、判断直观、避免人为因素干扰[14]。荧光定量PCR技术在检测手足口病病毒全程只需3个多小时，为快速诊断手足口病提供最快的实验室检测手段，有助于手足口疫情的监测。

本研究同时采用两种PCR技术检测手足口病病原体，此两种实验技术分别是实时荧光定量PCR和常规PCR。且这两种方法检测手足口病的阳性率分别为66.67%和21.67%，此次研究结果表明实时荧光PCR法检测手足口病阳性率明显高于常规PCR，差异有统计学意义（P<0.05），说明实时荧光定量PCR避免漏检的风险，为临床提供准确的结果有利于早发现疫情。该研究采用实时荧光定量PCR技术方法和常规PCR技术方法分别检测肠道病毒的阴性和阳性来确定其特异性，发现两者检测阴性和阳性是一致的，所以两者方法都具有特异性，证明采用PCR技术诊断该病具有特异性，防止临床上漏诊误诊的风险。通过检测系列稀释的已知拷贝数的RNA 浓度根据最低效价比来确定其灵敏度，发现对照组最低检测限均为4.11×103 cfu/mL。而观察组最低检测限均为4.11×102 cfu/mL，证明荧光定量PCR技术具有更高的灵敏性，有利于疾病的检出。此研究与王冰等[15]研究结果一致，表明实时荧光定量PCR技术比常规PCR技术在检测手足口病更有优势，为临床手足口病防治提供了依据。

综上所述，荧光定量PCR技术在检测肠道病毒不仅具有特异性高，还具有灵敏度高、检测时间快的特点，有助于更快诊断手足口病，更好的服务于临床。

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（收稿日期：2019-12-13）