王芳+康超+李永霞

摘要：根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌ompA基因序列，设计1对特异性引物，PCR扩增弗氏柠檬酸杆菌ompA基因片段，T克隆到pMD-18T载体上构建标准阳性质粒。通过SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件优化，建立弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法，结果显示重复性好、特异性高，灵敏度可达1.0×101拷贝/μL，说明建立的弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法适合于弗氏柠檬酸杆菌病临床疑似病料样品的快速诊断。对分离得到的83株弗氏柠檬酸杆菌进行药敏试验，结果表明冷水鱼养殖中耐药性问题日益严重。

关键词：弗氏柠檬酸杆菌；荧光定量PCR；快速诊断；耐药性

中图分类号： S855.1+2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）11-0286-04

弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）是革兰氏阴性菌、短杆菌，该菌在水体、土壤中广泛存在，是一种条件致病菌，可引起人、畜、鱼类的败血症[1-3]。近几年，贵州省冷水鱼的养殖发展迅速，主要品种有虹鳟、金鳟、斑点鳟鲑、鲟鱼、大鲵。随着冷水鱼养殖场（户）集约化程度不断提高，苗种流通交换量不断加大，病害逐渐增多，病情不断愈趋复杂。目前，弗氏柠檬酸杆菌感染的病害报道主要集中在鲟鱼、虾、中华鳖，而鳟鲑鱼、大鲵报道较少。感染该菌的鲟鱼、虾、中华鳖、鳟鲑鱼和大鲵出现消化不良或拒食，头部、腹部肿大，轻度腹水，皮下有出血点等症状[4-7]。传统的细菌分离鉴定耗时较长，不能快速、准确地得到鉴定结果。荧光定量PCR技术进行疾病病原菌的鉴定和诊断，较普通PCR反应程序快、特异性强、灵敏度高、重复性好、结果简单可视。本研究根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌ompA序列，设计1对特异性引物，PCR扩增出ompA基因片段，克隆到pMD-18T载体上，构建阳性标准品。……