杨愈刚 姚开源 薛吓娟 郑枝忠 郭银枞

(福建医科大学附属漳州市医院肛肠外科,漳州 福建 363000)

结肠癌是中国最常见的恶性肿瘤之一,占2013年所有肿瘤死亡人数的6%～8%[1-2]。结直肠癌的早期诊断可显著提高患者的生存率，降低该恶性肿瘤患者的死亡率，但仍有不足40%的患者存在局限性[3-5]。microRNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，通过转录后水平调控基因表达[6-7]。 随着miRNA和癌症之间的联系在2002年首次被报道[8],此后越来越多的证据表明异常表达的miRNA可以影响癌症的发展，并发挥抑癌或致癌基因的作用。2008年P.S.Mitchell等报道[9]，血清或血清中miRNA可作为生物标志物预测患者预后。miR-34a在多种肿瘤中发挥抑瘤基因的功能，如食管鳞状癌、肝细胞癌、结肠癌和神经母细胞瘤[10-13]。但miR-34a在结肠癌中的临床意义尚不清楚。本研究旨在探讨miR-34a在结肠癌血清中的表达情况和诊断价值。

1 材料与方法

1.1患者及采血情况 本研究共纳入2010年1月至2013年5月在我院就诊行手术治疗的结肠癌患者126例，患者信息见表1。并招募了同期在我院健康体检的66名志愿者作为健康对照组。结肠癌组中，男76例，女50例，年龄25～74(54.7±13.3)岁,术前均未接受化疗或放疗；健康对照组中，男39例，女27例，年龄21～73(51.2±12.9)岁。两组年龄和性别等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究得到了福建医科大学附属漳州市医院伦理委员会的批准。每位受试者签署了书面知情同意书，按照相应伦理和法律标准对所有标本进行匿名处理。样本均在清晨从所有参与者静脉血中抽取5 mL全血。所有血液样本在12 000 rpm离心20 min在12000 rpm离心10 min,在4°C收集上层清液，随后储存在-80°C待进一步分析。

表1 结肠癌患者血清miR-34a表达与临床指标之间的相关性

1.2RNA 抽提和实时定量聚合酶链反应 RNA 抽提和实时定量聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)依照参考文献[16]，用2-ΔΔCt计算miR-34a在血清中的相对表达水平，cer-miR-39作为内参基因。

1.3统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，计量资料以(Mean±s)表示，行t检验，计数资料行χ2检验，采用Kaplan-Meier曲线法进行患者生存率的单因素分析，组间的总体生存率和无瘤生存率的比较采用Logrank检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1miR-34a在血清中的表达水平 miR-34a在结肠癌患者术前血清水平(0.428±0.027)明显比健康对照组(0.774±0.039)表达低(P<0.001,图1A)。此外,无远处转移的结肠癌患者术前血清miR-34a表达水平(0.494±0.042)明显高于有远处转移的结肠癌患者术前血清(0.375±0.035)(P=0.031,图1B)。无淋巴结转移的结肠癌患者术前血清miR-34a表达水平(0.521 ± 0.041)明显高于有远处转移的结肠癌患者术前血清(0.354±0.034) (P=0.002,图1C)。

注：A.在结肠癌患者中，miR-34a表达显著低于对照组；B.miR-34a在远处转移的结肠癌患者中的表达明显低于未转移的结肠癌患者；C.miR-34a在有淋巴结转移的结肠癌患者中的表达明显低于无转移的结肠癌患者。图1 miR-34a在血清中的表达水平

2.2miR-34a在结肠癌患者术前和术后血清中表达水平 术后血清样本miR-34a的相对表达水平(0.676 ± 0.028)显著高于术前血清样本(0.428 ±0.027)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3术前血清miR-34a表达与结肠癌临床病理指标的关系 将126例结肠癌患者术前血清miR-34a表达的中位数分为高/低组。术前血清miR-34a的低表达与结肠癌的远处转移(P=0.032)、淋巴结转移(P<0.001)、TNM分期(P=0.004)密切相关。而术前血清miR-34a的表达与年龄、性别、术前癌胚抗原(CEA)水平、组织学分级、肿瘤大小等指标无显著差异(P>0.05)。

2.4术前血清miR-34a表达与结肠癌患者预后关系Kaplan-Meier生存分析显示，术前血清miR-34a低表达组的患者总体生存时间和无瘤生存时间显著较术前miR-34a高表达组的患者总体生存时间和无瘤生存时间短(总体生存：P=0.033，图2A；无瘤生存：P= 0.004，图2B)。

注：A.126例结肠癌患者总生存率Kaplan-Meier曲线；B.126例结肠癌患者无瘤生存率Kaplan-Meier曲线。图2 术前血清miR-34a表达与结肠癌患者预后关系

3 讨 论

本研究首先探讨了血清miR-34a作为结肠癌患者无创生物标志物的潜在临床应用价值。首先，结肠癌患者术前血清miR-34a水平明显低于健康对照组。其次，有淋巴结转移或远处转移的结肠癌患者术前miR-34a水平低于无淋巴结转移或无远处转移患者。第三， 结肠癌患者术前血清miR-34a低表达与临床恶性指标密切相关。最后，术前低miR-34a表达的结肠癌患者OS和DFS较差。以上研究数据表明，结肠癌患者术前血清中低表达的miR-34a预后不良。

研究[10-12]表明，miR-34a广泛表达于各种组织和器官，在多种恶性肿瘤中下调表达。miR-34a已被证实是一种可以抑制许多关键癌基因的肿瘤抑制因子[13]。以往研究证实miR-34a可通过下调HMGB1基因表达抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭[14-15]。在本研究中，我们的结果显示miR-34a在结肠癌患者中高度下调并与预后不良相关，这些结果与上述的报道一致。本研究首次报道了结肠癌患者血清中低表达的miR-34a可作为预测结肠癌预后的血清标志物和新的潜在治疗靶点。然而，本研究仍然存在一些局限性，例如：样本量相对较小和单中心回顾性设计。因此，需要更大规模、随访时间更长的前瞻性研究来验证本研究结果的准确性。此外，miR-34a在结肠直肠癌中的潜在分子机制仍然尚未完全明确。还需要进一步的实验来阐明miR-34a在结直肠癌中进展的分子学机制。

本研究首次证实了结肠癌患者中术前血清miR-34a的表达水平低于正常对照组,且血清中低表达的miR-34a与结肠癌患者的不良预后密切相关,暗示miR-34a可能在结肠癌进展中扮演关键的角色。