周 影,魏启舜,王 琳,郭成宝,赵荷娟,文蔚明

(江苏丘陵地区南京农业科学研究所,江苏 南京 210046)

氨基酸是构建生物有机体的众多生物活性大分子之一,也是构建生物细胞、修复组织的基础材料[1]。肥料中的游离氨基酸能够被植物直接吸收利用,提高肥料利用率和作物养分的转化率,促进作物生长,提高施肥对象的抗病性,改善施肥作物的品质等功能,对于植物的生长有着重要的意义[2-4]。目前生产中多采用发酵菜粕[5-6]、鱼粉,酸解病死畜禽[7],酶解羽毛、血液等方法获得氨基酸液体肥,这些方法成本高,存在二次污染等风险,不利于大面积推广应用。

羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物,全球每年产量达数百万t[8],但因缺乏有效实用的转化利用手段,大部分被作为废弃物直接丢弃[9]。家禽羽毛属天然角蛋白质,其粗蛋白含量高达80%以上[10-11],是一种具有潜在应用价值的蛋白质,可成为动物所需的重要蛋白来源[12-13]。水解利用羽毛蛋白质生产复合氨基酸具有潜在的经济效益[14]。

用传统的酸碱水解和高压蒸煮的方法处理农业废弃物存在很多弊端,因此生物发酵方法成为首选。目前已发现30余种微生物可用于羽毛角蛋白的降解,主要包括细菌类的芽孢杆菌属[15-16]、真菌类的曲霉属[17]、放线菌的链霉菌属[18]。然而目前用微生物降解羽毛大多以提高酶活、生产角蛋白酶为主要目的。而通过改进发酵工艺,以提高降解液中游离氨基酸含量为目的的研究鲜见报道。

我们利用本研究室前期筛选获得的1株能有效降解羽毛的地衣芽孢杆菌ZSZ6液体发酵降解羽毛，探究了外加碳氮源、温度、初始pH值、装液量、羽毛量、 接种量等不同发酵条件对其降解羽毛产游离氨基酸的影响,以期提高产物中的氨基酸含量,为畜禽养殖和屠宰加工废弃物的肥料化利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 地衣芽孢杆菌菌株由江苏丘陵地区南京农业科学研究所微生物实验室筛选、保存。

1.1.2 羽毛 从市场上收集。经去杂、自然风干后切成1～3 cm长，备用。

1.1.3 试验培养基 种子培养基:胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L, pH 7.2～7.4；在121 ℃下高压灭菌20 min。

基础发酵培养基:磷酸二氢钾1 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、氯化钠1 g/L, pH 7.2～7.4；在121 ℃下高压灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 游离氨基酸含量的测定 采用茚三酮法(GB/TB 314─2002),并在此基础上稍作修改。

1.2.2 羽毛降解率的测定 发酵液离心后倒掉上清液,残渣经105 ℃烘干至恒重,计算降解率，计算公式为：羽毛降解率(%)=(底物羽毛干重-降解后残渣干重)/底物羽毛干重×100。

1.2.3 外加碳源对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 向基础发酵培养基中加入0.5%质量分数羽毛的基础上,分别加入1%的乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉5种碳源,以不外加碳源为对照,初始pH 7.2～7.4,装液量50 mL/250 mL三角瓶,接种量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min条件下发酵培养72 h，然后测定游离氨基酸的含量。

1.2.4 外加氮源对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 向基础发酵培养基中加入0.5%质量分数羽毛的基础上,分别加入1 g/L的硝酸钠、酵母粉、硫酸铵、蛋白胨、尿素和牛肉膏6种氮源,以不外加氮源为对照,初始pH 7.2～7.4,装液量50 mL/250 mL三角瓶,接种量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min条件下发酵培养72 h，然后测定游离氨基酸的含量。

1.2.5 温度对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 向基础发酵培养基中加入0.5%质量分数的羽毛,初始pH 7.2～7.4,装液量50 mL/250 mL三角瓶,接种量2%(v/v),分别在180 r/min+25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃条件下发酵培养72 h，然后测定游离氨基酸的含量。

1.2.6 初始pH值对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 向基础发酵培养基中加入0.5%质量分数的羽毛,调节初始pH值分别为5、6、7、8、9,装液量50 mL /250 mL三角瓶,接种量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min条件下发酵培养72 h，然后测定游离氨基酸的含量。

1.2.7 装液量对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 向基础发酵培养基中加入0.5%质量分数的羽毛,初始pH 7.0,设置装液量分别为50、75、100、125、150 mL/250 mL三角瓶,接种量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min条件下发酵培养72 h，然后测定游离氨基酸的含量。

1.2.8 底物羽毛量对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 基础发酵培养基初始pH 7.0,装液量125 mL/250 mL三角瓶,分别添加0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%质量分数的羽毛,接种量2%(v/v),在37 ℃、180 r/min条件下发酵培养96 h，然后测定游离氨基酸的含量。

1.2.9 接种量对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 向基础发酵培养基中加入5%质量分数的羽毛,初始pH 7.0,装液量125 mL/250 mL三角瓶,接种量设1%、2%、3%、4%、5%(v/v),在37 ℃、180 r/min条件下发酵培养96 h，然后测定游离氨基酸的含量。

1.2.10 降解时间对羽毛发酵产游离氨基酸的影响 按优化后的工艺(培养基初始pH值7.0,装液量125 mL/250 mL,底物羽毛量5%质量分数,接种量2%体积分数,发酵温度37 ℃,离心转速180 r/min)进行羽毛发酵培养,连续培养12 d,每天取样测定样品中的游离氨基酸含量,并测定羽毛降解率。

1.3 数据分析

应用Excel 1997-2003和SPSS 19软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 外加碳、氮源对降解羽毛产游离氨基酸的影响

有研究表明,外加碳、氮源能够补充营养物质,促进细菌生长。本研究结果(图1、图2)显示,外加乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉对地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛产游离氨基酸均未产生促进作用,发酵液中游离氨基酸含量均低于纯羽毛的对照。外加不同氮源的处理羽毛降解情况均差于纯羽毛的对照；部分降解液中游离氨基酸含量高于对照，这可能是外加氮源在发酵过程中被菌体降解产生的。分析原因,外加碳、氮源有利于菌体的生长,相较于难以利用的羽毛,地衣芽孢杆菌会优先选择利用外加营养物质，因而不产生角蛋白酶,从而影响了其对羽毛的降解,不利于游离氨基酸的产生。因此,对于地衣芽孢杆菌ZSZ6来说,培养基中外加碳、氮源并未能对其降解羽毛产氨基酸起到促进作用,其可以羽毛为唯一营养源而获得较好的降解效果。

图2 不同氮源对羽毛发酵产游离氨基酸的影响

2.2 温度对降解羽毛产游离氨基酸的影响

温度是影响微生物生长及分泌代谢产物的重要影响因素。温度过高或过低均不利于微生物的生长,进而影响羽毛降解效果[19]。本研究结果(图3)表明,温度对菌株降解效果的影响较为显著。随着降解温度的升高,发酵液中游离氨基酸含量呈先增加后减少的趋势。在25、30 ℃温度下游离氨基酸含量均较低；当温度升至35 ℃时，发酵液中游离氨基酸含量增加较多,达到1.15 g/L；当降解温度为37 ℃时，游离氨基酸含量最高，达1.44 g/L,较35 ℃条件下提高了24.9%；当温度升至40 ℃时，降解液中游离氨基酸含量则开始下降。上述结果说明,37 ℃的温度可能是地衣芽孢杆菌ZSZ6的最适生长温度,该温度条件有利于菌体的生长,从而促进羽毛的降解,提高发酵液中游离氨基酸的含量。

图3 温度对羽毛发酵产游离氨基酸的影响

2.3 初始pH值对降解羽毛产游离氨基酸的影响

本实验设置5～9范围的初始pH值,结果(图4)显示,发酵培养基过酸或过碱均不利于菌体的生长,当pH值为5时,发酵液中的游离氨基酸含量最低,仅为0.18 g/L,且羽毛降解效果最差；当pH值升至6时,氨基酸含量显著增加,是pH 5时的4.9倍；当初始pH值为7时,产物中游离氨基酸含量最高,达1.02 g/L；在pH 8和pH 6条件下的氨基酸含量接近,但都小于pH 7下的；当pH值调节为9时,氨基酸含量降低明显。表明,地衣芽孢杆菌ZSZ6适宜的生长pH值偏中性。

图4 初始pH值对羽毛发酵产游离氨基酸的影响

2.4 装液量对降解羽毛产游离氨基酸的影响

装液量的多少影响发酵液的溶氧量,对菌体的生长、代谢会产生一定的影响,直接影响到菌株的产酶活性和对羽毛角蛋白的降解,从而影响到发酵液中游离氨基酸的含量[20]。从图5可以看出，随着装液量的增加，发酵液中游离氨基酸含量呈先增加后减少的趋势。具体来说：当装液量为50～125 mL时,随着装液量的增加,发酵液中游离氨基酸含量升高,在装液量为125 mL时,发酵液中游离氨基酸含量达到最大值(1.05 g/L)；当装液量增加到150 mL时,产物中游离氨基酸含量开始下降(0.95 g/L)；当装液量达到150 mL时,培养液中总溶氧量减少，不能满足好氧细菌对氧气的需求,从而抑制了菌体的生长与代谢。在本实验条件下,选用125 mL/250 mL的装液量效果最佳。

图5 装液量对羽毛发酵产游离氨基酸的影响

2.5 羽毛添加量对游离氨基酸产量的影响

在本实验条件下,羽毛作为地衣芽孢杆菌ZSZ6降解产游离氨基酸的唯一碳、氮来源,其含量多少对整个发酵过程至关重要。图6显示：当底物羽毛含量在0.5%～5%时，随羽毛量的增加产物中游离氨基酸含量逐渐增多；当羽毛含量为5%时,氨基酸含量最高,达13.15 g/L；当继续增加底物羽毛量至6%时,产生的游离氨基酸含量开始下降；当羽毛添加量增加到7%时,氨基酸含量下降明显。这可能是由于羽毛量过多会影响料液比,发酵液溶氧量减少,不利于菌体生长,从而影响降解效果。同时,角蛋白酶是一种诱导酶,作为诱导物的羽毛含量对菌株的发酵产酶产生影响,但过量羽毛角蛋白添加会降低菌株产酶[21],不利于羽毛的降解。

2.6 接种量对羽毛降解效果的影响

图6不同接种量的实验结果表明：当接种量为1%～2%时,发酵液中的游离氨基酸含量随接种量的增加而增大；当接种量为2%时，获得的氨基酸含量最高,为12.15 g/L；在3%和5%的接种量产物中的游离氨基酸含量相近,且仅次于2%的处理；接种量为1%和4%时获得的游离氨基酸含量相当,且较低。说明接种量对菌株代谢产生游离氨基酸的影响并非线性关系。综合考虑降解效果和经济效益,采用2%的接种量用于羽毛降解产游离氨基酸最为理想。

图6 底物量对羽毛发酵产游离氨基酸的影响

图7 接种量对羽毛发酵产游离氨基酸的影响

2.7 羽毛降解时间曲线

综合上述优化的最佳发酵条件,连续发酵12 d,每天测定发酵产物中的游离氨基酸含量及羽毛降解情况。结果(图8)显示,降解液中的游离氨基酸含量呈现先增加后减少的趋势。具体而言，在降解第2天，发酵液中的游离氨基酸含量迅速增加；在降解第2～5天为快速增长期,产物中的游离氨基酸含量迅速增加,且增幅较大，在发酵第5天时含量达到17.51 g/L；之后产物中的氨基酸含量增速放缓,到第9天达到峰值(19.47 g/L)后开始下降；在降解第12天时,游离氨基酸的含量为15.23 g/L,比高峰值减少了4.24 g/L。究其原因，可能是随着时间的推移,微生物降解羽毛产生的氨基酸被用于自身的生长代谢[22],且消耗的速率大于羽毛降解产氨基酸的速率。

羽毛降解率随发酵时间的增加而不断升高。在发酵第5天降解率即达到70%以上；在发酵第12天降解率最高,为80.8%。由图8可知：在发酵第1天仅有少量羽毛被降解；在第2天和第3天为快速降解期,羽毛降解速率最快；之后降解速率开始下降。分析原因，可能是随着发酵时间的延长,ZSZ6降解羽毛产生高浓度的游离氨基酸及其它代谢产物,影响角蛋白酶的分泌及活性；同时,角蛋白酶的自身水解也直接影响了羽毛的降解[14]。

图8 发酵时间对羽毛降解率及氨基酸含量的影响

3 结论与讨论

随着人们对环境保护的重视,利用生物方法处理角蛋白类废弃物被越来越多的研究者关注。刘艳海等[23]研究发现,嗜热性地衣芽孢杆菌Y6(BacilluslicheniformisY6)在最适发酵温度55 ℃条件下72 h可降解除羽轴外的羽枝部分,所产蛋白酶为耐热碱性蛋白酶;当解淀粉芽孢杆菌3-2以乳糖为外加碳源时发酵羽毛产氨基酸,可用于生产氨基酸复合肥料[14]；地衣芽孢杆菌NJU-1411-1和链霉菌B221固体发酵废弃羊毛产角蛋白产品,可用作饲料蛋白添加剂[24];地衣芽孢杆菌NJ-01用于分解鸽羽毛,37 ℃ 5 d鸽羽毛开始分解,在37 ℃下培养15 d时鸽羽毛小羽枝、羽毛梗全部分解为碎片[25]。

相较于前人的研究,本研究中地衣芽孢杆菌ZSZ6可有效降解羽毛废弃物,且降解条件要求简单,降解效率高,发酵可产生较高浓度的游离氨基酸。通过单因素试验考察外加不同碳源和氮源、不同温度、初始pH值、装液量、底物羽毛量、接种量等对羽毛降解效果的影响，结果表明:在基础发酵培养基初始pH值7.0、羽毛添加量5%、装液量125 mL/250 mL、接种量2%、发酵温度37 ℃条件下培养5～9 d,发酵液中游离氨基酸含量最高,达19.47 g/L。在优化条件下发酵5 d,产物中游离氨基酸含量即达17.51 g/L,羽毛降解率在70%以上。说明利用地衣芽孢杆菌ZSZ6降解羽毛可有效实现畜禽养殖废弃物的资源化利用,产物可用于生产氨基酸产品。