阮 凌

(西安石油大学 体育系，陕西 西安 710065)

目前，2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)已成为一个人们生活中重要的健康问题，由于生活方式的改变，使其发病率在全球迅速上升，并呈现出逐年增加的趋势[1]。有研究表明，不良的生活方式将会诱发T2DM，占T2DM发病率的90%[2-3]。T2DM治疗的核心目标是通过降低血糖，从而改善胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)。一般来说，可溶性膳食纤维对血糖和血清胰岛素有改善的效果[4-6]。因此，通过改变饮食习惯，如摄入更多的高膳食纤维来改善T2DM具有良好的效果。

流行病学的研究证实，摄入高纤维饮食可以起到降低体重和血脂水平的作用。有研究表明，高膳食纤维可以抑制食欲，减少能量摄入，从而起到降低体重的作用。魔芋是一种亚热带植物，它是一种可食用的球茎，被称为天然纤维，长期以来作为亚洲地区的传统食品。魔芋多聚糖(Konjac Glucomannan,KMG)是一种从魔芋粉中提取的天然多糖类物质。KGM对人体健康有益，是一种高质量的可溶性膳食纤维。国内学者研究认为，KMG是一种有益的营养素，有预防和改善2型糖尿病的效果，KMG显著降低了血糖和血清胰岛素水平，改善了脂质代谢。而KGM调节脂质代谢的机制，促进肠道黏液的生长，改善排便[7]。

本研究旨在通过魔芋多聚糖改善T2MD大鼠血糖，胰岛素抵抗，脂代谢指标，炎症因子和相关蛋白质的表达，试图发现其潜在的分子机制。

1 研究方法

1.1 材料与方法

FBG、FIN、TC、TG、LDL-C和HDL-C的测定试剂盒(南京建成生物技术有限公司)。TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒进行测试(武汉BOSTE生物技术有限公司)。采用免疫印迹法测试GLUT-4、IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731(武汉BOSTER生物技术有限公司)。

1.2 实验动物模型与设计

雄性SD大鼠(180～220 g，7～8周)从西安交通大学实验动物中心购买。大鼠在动物实验中心(23±1 ℃，湿度60%～70%，12 h光/12 h暗周期)环境中饲养。所有大鼠进行1周的适应性喂养。SD大鼠(n=40)被随机分成2个实验组，喂食标准啮齿动物饮食的正常对照组(NC;n=10)和高脂饮食组(HFD;n=30)。高脂饲料含40%脂肪、18%蛋白质、42%碳水化合物。喂养2周后，高脂饮食组在禁食12 h后，注射40 mg/kg链脲佐菌素(STZ)。在STZ注射72 h后尾静脉取血，测试血糖值，将血糖维持在16.7 mmol/L以上的大鼠确定为2型糖尿病大鼠[8]。

2型糖尿病大鼠模型建立后，将所有大鼠分为3组，正常对照组(NC，n=10)，喂养普通饲料；2型糖尿病模型大鼠随机分为2组，2型糖尿病组(DM，n=10)；喂养普通饲料8周；2型糖尿病魔芋多聚糖组(DK，n=10)，以含有KMG的饮食喂养持续8周[9]。

1.3 魔芋多聚糖饲料配方

采用10%的魔芋多聚糖混合基础饲料(面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮25%、豆料20%、鱼粉2%、骨粉3%；其中，脂肪提供能量占18%、蛋白质占32%，碳水化合物占50%)添加成分和水按一定比例混合成团，将混匀的饲料团块填充到实验大鼠特配饲料自制装置中，压实，然后用注射器活塞将饲料推出，魔芋多糖特配饲料采用高温烘干。

1.4 血清指标测定

8周后实验结束时，所有大鼠禁食12 h，取血液和腓肠肌样本。从腹主动脉采集血液样本，用离心机在3000 r/min下离心15 min，然后取血清。使用全自动分析仪测试TG(mmol/L)、TC(mmol/L)、LDL-c和HDL-c水平(mmol/L)。采用ELISA法检测TNF-α、IL-6的含量。

1.5 口服葡萄糖耐受性试验(OGTT)实验

在实验结束时进行口服葡萄糖耐受试验(OGTT)实验。SD大鼠分别在对照组和2型糖尿病模型组随机选取。禁食12 h后,使用尾静脉的血液样本测试FBG和FIN。然后,大鼠接受OGTT测试(2克/千克体重)[8]。胃内注射后，在0、30、60和120 min尾静脉测量血糖和血胰岛素水平[10-11]。

1.6 免疫印迹法测试

骨骼肌称重后用冷盐水清洗，IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731的腓肠肌蛋白表达的用免疫印迹法测定。SDS-PAGE电泳后，将蛋白质转移到PVDF膜，室温下用TBS/T封闭液体(TBS含有0.1%～20.5%脱脂奶粉)PVDF膜孵育2 h，TBS/T缓冲液冲洗3次,每次5 min。用抗稀释剂稀释(TBS/T含有5%BSA)稀释一个抗体(抗体为1∶1000制备)，并在4 ℃的TBS/T缓冲液冲洗，孵育PVDF膜，3次/5 min，然后膜和两个电阻(1∶5000)，封闭稀释液体在室温孵育1 h，TBS/T缓冲液冲洗。将化学发光试剂A液体与B液体混合，孵育PVDF膜1 min，并在凝胶成像器中成像。

1.7 统计分析

各组数据应用SPSS 16.0统计软件和Excel 2007加载软件包进行分析。实验数据采用平均数±标准差(Mean±SD)表示，所有数据比较在确定方差齐性后(P>0.05)进行组间比较；各组间采用单因素方差分析，两样本间比较采用t检验，以P<0.05为差异，具有统计学意义，P<0.01为具有非常显著性差异。

2 结果与分析

2.1 每组大鼠OGTT后葡萄糖和胰岛素的变化

采用OGTT测试，与NC组相比，DM组从30～120 min(P<0.01)血糖和胰岛素含量明显升高(图1A)。与DM组相比，DK组血糖(P<0.05，图1A)和胰岛素水平显著性降低(P<0.05，图1B)。

2.2 各组大鼠血清指标的变化

由表1可知，各组大鼠血糖、血清胰岛素和HOMA-IR的变化。与NC组相比，DM组中FBG和FIN升高(P<0.05)。经过8周的KMG补充，与DM组相比，DK组血糖、血清胰岛素和HOMA-IR(P<0.05)明显减少。

表1 各组大鼠血清指标的变化

DM组中的TG和TC水平明显高于NC组(P<0.05)。此外，与DM组相比，DK组的TG和TC水平显著下降(P<0.05)。然而，每组HDL-c和LDL-c没有显著变化(P<0.05)。

2.3 各组大鼠炎症细胞因子的变化

由去2可知，各组大鼠IL-6和TNF-α的变化，与NC组相比，DM组中的IL-6和TNF-α显著增加(P<0.05)，与DM组相比，DK组中TNF-α显著减少(P<0.05)。

*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05,与DM组相比。图2 不同处理组大鼠炎症细胞因子的变化

2.4 各组大鼠GLUT-4的蛋白质表达

由图3可知，与NC组相比，DM组GLUT-4蛋白水平明显下降(P<0.01)。8周的魔芋多聚糖干预，DK组的GLUT-4蛋白表达高于DM组(P<0.01，图3)。

*P<0.05，与NC组相比。图3 不同处理组大鼠GLUT-4的蛋白质表达

2.5 各组大鼠IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731蛋白在腓肠肌中的表达

由图4可知，与NC组相比，DM组和DK组中的pIRS1Ser730显著降低(P<0.05)，与DM组相比，pIRS1Ser730在DK组显著增加(P<0.05)。DM组和DK组中，IRS2明显高于NC组，而DM组和DK组中pIRS2Ser731明显低于NC组。然而，IRS1的表达在各组之间没有显著的差异(P>0.05)。

*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05,与DM组相比。图4 不同处理组大鼠IRS1、pIRS1Ser730、IRS2和pIRS2Ser731蛋白在腓肠肌中的表达

3 讨论

在本研究中，笔者采用高脂饮食诱导和STZ注射的方式，建立了2型糖尿病模型大鼠。与前人的研究一致，使用HFD和STZ可以建立了T2MD大鼠模型[12]，高脂饮食会导致高血糖，高胰岛素血症和胰岛素抵抗[13-15]。使用HFD和STZ诱导这种2型糖尿病大鼠模型与人类T2MD的发生相同[16]。本研究发现KMG对T2DM大鼠的血糖、血脂、炎症因子和胰岛素信号通路蛋白的表达，有改善的作用。

本研究结果表明，2型糖尿病组葡萄糖耐受性和胰岛素抵抗能力受损，因此，血糖和血清胰岛素水平明显高于正常对照组。同时，高血糖还可激活各种信号通路，导致ROS大量增加并诱导胰岛素抵抗[17]。胰岛素抵抗的特征是T2DM发病机制的中心环节，导致T2DM大鼠糖代谢紊乱，同时，由于胰岛素抵抗和胰岛素缺乏，血清TG、TC和LDL-c的含量升高，成为T2DM的常见特征。有研究表明，2型糖尿病的脂质增加造成机体脂代谢异常，过量的脂质是导致胰岛素抵抗的重要原因之一[18-19]。

KMG的补充显著地改善了血糖水平和胰岛素抵抗。每天摄入KGM对改善血糖有益。本研究结果表明：KMG补充8周后，对2型糖尿病大鼠的血糖和胰岛素抵抗得到改善。此外，摄入KGM对HOMA-IR也有改善作用。最新研究表明，KMG在降低血脂和改善IR方面均有效。魔芋多聚糖可以降低血糖和血脂，同时促进肠道蠕动。本研究与前人的研究结果一致，2型糖尿病组大鼠的TG和TC水平明显较高，但补充KGM后TG和TC水平下降[20]。其机制可能是KMG吸收水分后膨胀，可以填充胃肠道，减少食物摄入量，增加饱腹感。然而，HDL-c和LDL-c在各组之间没有显著差异。

2型糖尿病除高血糖、高脂血症和胰岛素抵抗外，还被作为一种炎性疾病。炎症细胞因子，如TNF-α和IL-6可降低机体胰岛素敏感性，同时，TNF-α和IL-6升高也损害胰岛素的信号通路。最新研究发现，TNF-α造成胰岛素抵抗表现为高脂血症，即外周胰岛素抵抗和胰岛素信号通路的抑制。结果表明，2型糖尿病大鼠，炎症细胞因子TNF-α和IL-6水平升高，然而，补充KMG饮食可以降低TNF-α水平。Kang等证明，KMG可明显改善机体炎症反应。另有研究表明，TNF-α水平升高与胰岛素抵抗有关。Alipourfard等[2]研究发现通过改善胰岛素敏感性，机体的TNF-α表达也减少。本研究也印证了KMG也可以通过降低TNF-α的表达，从而达到改善胰岛素的敏感性的作用。

本研究试图通过IRS的信号通路蛋白表达，来说明魔芋多聚糖改善2型糖尿病大鼠的作用。胰岛素受体(IRS)在胰岛素信号通路中起到非常重要的作用，IRS是胰岛素受体后信号细胞内传导的重要组成部分，在胰岛素抵抗中起到重要作用。IRS-1和IRS-2的主要作用已经得到了证实，它们作为细胞表面受体和细胞内信号级联之间的纽带。IRS-1是胰岛素信号通路的上游通路蛋白，是胰岛素抵抗的负调节器，其磷酸化的增加会导致IRS-1酪氨酸磷酸化，并调节细胞对胰岛素的反应，从而起到调节糖代谢。同时，IRS-2在胰岛素信号介导系统中也起着重要的作用，它具有调节胰岛素和细胞因子分泌作用。此外，GLUT-4是胰岛素信号转导通路蛋白的关键因素，它将葡萄糖从血液转移到组织中。本研究发现，2型糖尿病大鼠的GLUT-4蛋白水平显著降低，而IRS-1的表达没有显著变化。因此，8周KMG补充对周围胰岛素抵抗有明显的改善作用，这可能与骨骼肌胰岛素信号通路障碍的改善有关。前人研究表明，HFD/STZ诱导大鼠出现胰岛素抵抗，炎症因子表达的增加，胰岛素信号通路上的蛋白质水平也发生变化。本研究中pIRS1Ser730在KMG补充组中比在T2MD组显著增加。此外，Ser307的IRS1磷酸化及其降解是由慢性胰岛素抵抗引起的。然而，没有观察到各组之间IRS1在腓肠肌中的表达有显著性差异。同时，KMG补剂可调节GLUT-4蛋白水平、IRS-2和IRS-2Ser731蛋白的表达，降低血糖，提高胰岛素的敏感性。

4 小结

本研究发现KMG对HFD和STZ诱导T2DM大鼠，有降低血糖、血脂，改善胰岛素抵抗，同时有抗炎的效果，但关于IRS信号通路的可能机制仍需进一步研究。